丁草胺降解菌的分离鉴定、降解特性研究及其N-脱烷基酶基因的克隆

发布时间：2020-04-11 01:47

【摘要】：氯代乙酰胺类除草剂是一类具有高效性、高选择性芽前除草剂。它们在全球范围内广泛使用。其主要代表品种丁草胺和乙草胺,年使用量分别超过1万吨和3万吨,主要用于一年生禾本科杂草和部分阔叶杂草的防除。该类除草剂对鱼类有较强的毒性,其中丁草胺被美国环保局定为L2类致癌物。由于它们具有水溶性高、土壤残留期长的特点,因此而导致的土壤残留不仅影响后茬作物生长还造成生态污染,所以环境中氯代乙酰胺类除草剂的残留引起人们的广泛关注。已有研究表明微生物降解是消除环境中氯代乙酰胺类除草剂的主要方式。因此本文以丁草胺为底物,分离筛选高效氯代乙酰胺类除草剂降解菌株,研究其对丁草胺的代谢途径及其克隆其中关键酶基因,从分子生物学水平上解析此类除草剂的降解机制。一、丁草胺降解菌株的分离和降解特性的研究以丁草胺为底物,以江苏常州水稻田采集的土样作为接种物,通过连续富集培养的方法得到两个能够降解丁草胺的富集液Yl和Y3,从富集液Y1中分离到菌株B1,从富集液Y3中分离到菌株B2和N7。根据菌株的表型、生理生化特性和16S rRNA基因同源比对,将菌株B1、B2初步鉴定为Rhodococcus sp.。菌株N7的分类地位在本文的最后一章研究。菌株B1在5天内对100 mg/L丁草胺的降解率为100%。菌株B2在12h内对100mg/L丁草胺的降解率为94%。菌株B1、B2降解丁草胺的最适温度和pH都为30℃和7.0。0.1 mM的Ag+、Ca2+、Ni2+和Hg2+对菌株B1降解丁草胺具有较强的抑制作用,其中以Hg2+、Ag+抑制作用最为强烈。0.1 mM的Ag+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Hg2+和Cu2+对菌株B2降解丁草胺具有较强的抑制作用,其中以Hg2+、Mn2+抑制作用最为强烈,而Mg2+则对菌株B1和B2降解丁草胺有一定程度的促进作用。在菌株B1、B2降解丁草胺的过程中,通过GC-MS检测到的代谢产物是2',6'-二乙基-2-氯乙酰苯胺(CDEPA)。菌株B1、B2都不能继续降解CDEPA。据此推测菌株B1、B2降解丁草胺通过切断丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺环上N原子之间的C-N键(Ⅳ-脱烷基作用来降解)。菌株B1能降解甲草胺、乙草胺、丙草胺和丁草胺,然而菌株B2只能降解乙草胺和丁草胺,菌株B1比菌株B2有更广的降解谱。因此,虽然菌株B1和B2都能通过切断丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺环上N原子之间的C-N键来降解丁草胺,但是催化该过程的酶可能不一样。在后续的研究中,我们将分别研究菌株B1、B2降解丁草胺的机制。菌株N7既不能降解丁草胺也不能降解CDEPA,但是它一直和菌株B2稳定共存在富集液中。利用菌株B2降解丁草胺后的培养物(去除B2细胞)来培养菌株N7发现菌株N7的细胞浓度升高,据此推测菌株N7利用菌株B2降解丁草胺产生的除CDEPA以外的其他代谢产物生长。二、菌株B1中的丁草胺降解酶Ch1H的纯化及特性研究基于菌株B1的粗酶液可以在含有丁草胺的琼脂平板上因降解丁草胺而产生水解圈的特性建立了一种定性检测丁草胺降解酶的方法。通过DEAE-Sepharose fast flow凝胶层析、Q-Sepharose fast flow凝胶层析和PAGE切胶回收电洗脱等纯化手段得到具有较高的丁草胺降解活性的丁草胺降解酶Ch1H,整个过程丁草胺降解酶纯化了185.1倍,酶的比活达到114.8 U/mg,最终得率为16.1%,分子量大小在45 KDa左右。Ch1H可以通过Ⅳ-脱烷基作用降解丁草胺生成CDEPA,初步推断为一个水解酶。Ch1H部分特性如下：降解丁草胺的最适温度为30℃,最适pH为7.0, 1.0mM Hg2+, Ca2+和Ni2+强烈抑制了降解酶Ch1H活性,1.0mM Fe2+对Ch1H有较强的抑制作用,1.0 mM的Mg2+有促进酶活的作用,酶活提高了1.1倍。降解酶Ch1H还可以降解甲草胺、乙草胺、丙草胺,Ch1H的最适底物为甲草胺,并且随着底物苯胺环N上连接的侧链长度的增加催化效率逐渐降低,水解效率为：甲草胺乙草胺丁草胺丙草胺。我们尝试了蛋白质N端测序等方法克隆编码Ch1H的基因,令人遗憾的是没有成功。在将来的研究中,我们将继续开展这方面的工作。三、通过比较基因组的方法克隆菌株B2中与丁草胺降解相关的Ⅳ-脱烷基酶基因在LB平板上连续传代菌株B1、B2的过程中,菌株B1的降解特性稳定存在,而B2菌株会出现功能丢失的情况,我们将其丢失功能的一个突变株称为TB2。采用Illumina MiSeq测序技术对菌株B2及突变菌株TB2进行基因组框架图测序。菌株B2测序草图信息如下：Scaffolds452个,碱基数量6,871,517 bp, ORFs 6,521个。菌株TB2测序草图信息如下：Scaffolds 101个,碱基数量6,716,155 bp, ORFs 6,411个。利用Omiga 2.0软件分析两株菌的基因组差别,结果显示在菌株B2中的scaffold51的末端大约30 K的片段在TB2中没有比对到,以此序列的不同区域为基础,设计四对引物,通过PCR的方法进一步验证该片段在TB2中不存在。将菌株TB2中丢失的片段中所有可能的ORF编码蛋白质的氨基酸序列与NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库上的蛋白质序列进行相似性比对,发现有一个基因簇由EthR、EthA、EthB、EthC、EthD五个基因构成,其中EthR编码属于AraC/XylS家族的调节蛋白(37 KDa),与其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001 的 EthR (99%); EthA编码铁氧还蛋白还原酶组分(43 kDa),与其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthA (99%); EthB编码细胞色素P450氧化酶组分(44 kDa),与其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthB (92%):EthC编码2Fe-2S型铁氧还蛋白组分(11 kDa),与其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthC (99%); EthD编码一个10 kDa的蛋白,与其相似性最高的是Rhodococcus ruberIFP2001的功能未知蛋白EthD (90%)。Rhodococcus ruber IFP2001是一株ETBE(乙基叔丁基醚)降解菌,它的EthRABCD基因簇负责ETBE的O上脱烷基功能(切断C-O),因此,我们推测菌株B2的基因簇EthRABCD可能具有类似的脱烷基功能,即切断丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺环上N原子之间的C-N键(Ⅳ-脱烷基作用)。为了验证基因簇EthRABCD的功能,将EthRABCD基因簇(含原始启动子)克隆到穿梭载体pRESQ上,构建重组质粒pQEth1,将其导入突变株TB2,其恢复了降解丁草胺的功能。为此,我们认为菌株B2的基因簇EthRABCD就是负责切断丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺环上N原子之间的C-N键的功能(N-脱烷基作用),互补菌株TB2 (pQEthl)在不经乙草胺诱导的情况下只能降解乙草胺和丁草胺,但是在乙草胺的诱导后还可以降解甲草胺和丙草胺。鉴于EthD在Rhodococcus ruber IFP2001菌株中是一个功能未知蛋白,我们又将EthRABC与pRESQ构建了重组质粒pQEth2,将其导入突变株TB2,它没有恢复降解丁草胺的功能,说明基因EthD编码的蛋白在降解中必不可少。其具体功能还需进一步研究。为了将EthABCD在大肠杆菌中表达,我们将其克隆到pET29a (+)上构建重组质粒(pET-EthABCD),将该质粒导入菌株E. coli BL21中,使该菌获得了降解乙草胺的功能,但活性很低。推测可能是由于密码子偏嗜性导致的表达量过低。通过实时荧光定量PCR以EthB为靶标基因,测定了EthB在氯代酰胺类除草剂诱导和葡萄糖诱导条件下的转录情况,结果显示EthB在甲草胺、乙草胺、丙草胺和丁草胺的诱导下,转录水平分别为葡萄糖诱导条件下的0.73倍,354倍,33倍和1.63倍,证明丁草胺和乙草胺可以诱导EthB的表达,其中乙草胺诱导效率最高。进一步研究发现,基因簇EthRABCD中的每个基因都受乙草胺的诱导,在乙草胺的诱导下EthR、EthA、EthB、EthC和EthD的转录水平相比葡萄糖诱导下提分别提高了326倍、256倍、354倍、321倍和263倍。通过PCR的方法在B1菌株中没有检测到EthRABCD基因簇的存在,这进一步证明了在菌株B1和B2中存在不同基因编码的酶来催化丁草胺的脱烷基作用。四、菌株N7分类地位的研究前文提到N7可以同菌株B2在以丁草胺为唯一碳源的富集液中稳定存在,它是利用菌株B2降解丁草胺的产物生长。对其16S rRNA基因序列相似性分析显示,菌株N7与Sphingobacterium multivorum IAM14316T的相似性为97.49%,与Sphingobacterium canadense CR11T的相似性为97.11%,与Sphingobacterium属中的其他细菌的相似性低于97%,且在系统分类树上菌株N7与Sphingobacterium multivorum IAM14316T、 Sphingobacterium canadense CR11T (AY787820) 和 Sphingobacterium siyangense SY1T(EU046272)构成一个系统分类分支。N7的主要的呼吸醌是MK--7、主要的脂肪酸是iso-C15:0(25.49%), C16:0 (7.92%), iso-C17:0 3-OH (6.98%),和summed feature 3 (comprising C16:1ω6c 和/或 C16:1 ω7c; 42.08%)、G+C含量为40.9±0.5 mol%,菌株N7与Sphingobacterium multivorum IAM14316T和Sphingobacterium canadense CR11T的DNA同源性分别为21%和15%,远低于70%(种间界定的阈值)。综合其它的多相分类数据确定菌株N7为Sphingobacterium属的一个新种,我们将其命名为Sphingobacterium changzhouense N7T (= CCTCC AB 2012100T= KACC 16854 T)。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X592;X172

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