Sphingomonas wittichii DP58降解吩嗪-1-羧酸和Sphingobium yanoikuyae

发布时间：2020-04-17 02:43

【摘要】：吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid PCA)是生物农药申嗪霉素的有效成分,对黄瓜和西瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病、水稻纹枯病等农作物病害具有显著的预防效果。研究表明申嗪霉素在土壤中的半衰期约为3.5天,微生物在降解过程中起到了关键作用,但其降解机理尚不清楚。随着申嗪霉素推广使用面积的不断扩大,其有效成分PCA在环境中的降解行为及对生态环境的影响等问题也越来越受到人们关注。另外,解析PCA的降解途径,尤其是第一步反应可以为减缓PCA在土壤中的降解速率提供理论支持。为了研究PCA的降解特性,课题组前期研究中筛选到一株PCA降解菌株S.wittichii DP58并获得其基因组序列信息,同时检测到两个降解中间产物:4-羟基-1-(2-羧基苯基)-2-氰基-2-氮杂环丁烯(HPAEC)和4-羟基-1-(2-羧基苯基)-2-氰基氮杂环丁烷(HPAC),但尚未找到PCA降解的初始基因。为了解析PCA的降解途径,我们首先归纳分析了菌株DP58,B1和24株可降解多环芳烃或杂环芳烃的Sphingomonas和Sphingobium属细菌的降解通路和核心降解通路中的加氧酶,发现以邻苯二酚为关键中间代谢产物的β-酮己二酸途径是Sphingomonas和Sphingobium中最主要的核心代谢途径,另外,Sphingomonas和Sphingobium菌属基因组中存在大量基因水平转移相关的元件,且相同降解通路的基因簇组成和基因相似度存在差异,同时说明2个属的细菌之间较多地存在着基因转移现象。接着我们发现菌株DP58降解PCA是诱导型的。为了寻找PCA降解相关的基因,我们对菌株DP58进行了转录组分析。以PCA为唯一碳源时,菌株DP58的甲苯降解通路、己内酰胺降解通路、硝基甲苯降解通路、多环芳烃降解通路和苯甲酸降解通路等异源物质代谢通路、鞭毛编码基因发生明显上调。环羟化双加氧酶被认为是芳烃化合物降解的关键酶,我们重点分析了转录组中羟化双加氧酶的表达变化,转录组中表达上调倍数最大的3个加氧酶编码基因位于同一个基因簇中,该基因簇包含2对双加氧酶(pcaA1A2,pcaB1B2)、1个电子传递链(pcaA3A4)、1个开环双加氧酶(pcaC)、1个单加氧酶(pcaD)、1个氧化还原酶编码基因(pcaE)和1个调控基因(pcaR)。通过基因簇的分段克隆和全细胞转化,确认该基因簇为PCA降解的基因簇,另外发现pcaA1A2A3A4可能编码PCA降解的初始双加氧酶。通过系统发育分析,我们发现PcaA1属于苯甲酸类降解双加氧酶,且与邻羟基苯甲酸水解酶相似度最高,表明PcaA1A2可能兼有PCA脱羧功能。PcaB1与氧芴、二苯并呋喃、咔唑和二苯并二恶英等杂环芳烃双加氧酶聚类在一起,说明PcaB1B2可能在下游途径中负责PCA中含氮杂环的开环。将基因pcaA1A2和pcaB1B2分别克隆到质粒pMD18-T中,在大肠杆菌中诱导表达后发现均不能转化PCA。接着我们将pcaA1A2、pcaB1B2分别与pcaA3、pcaA4串联克隆到达pMD18-T中,进行诱导表达和全细胞转化,发现只有pcaA1A2 A3A4一起表达时才能将PCA转化为1,2-二羟基吩嗪。以~(13)C标记的PCA为底物的转化实验发现反应液顶空中~(13)CO_2的含量明显升高,这说明PCA 1,2-双加氧酶催化PCA脱去的羧基形成二氧化碳而不是作为碳源被利用。以上结果说明pcaA1A2A3A4编码PCA降解的初始双加氧酶(命名为PCA 1,2-双加氧酶),其功能是催化PCA脱羧和羟基化形成1,2-二羟基吩嗪。为了进一步研究PCA 1,2-双加氧酶的催化特点和酶学特性,我们将pcaA1A2克隆到质粒pBBR2S中并转入P.putida KT2440,将pcaA3和pcaA4克隆到pET28a(+)中并转入E.coli BL21(DE3),分别对三个表达菌株进行诱导和目的蛋白纯化。SDS-PAGE分析发现,PcaA1A2由两个亚基组成,其分子量约为46和17 kDa,PcaA3的分子量约为47 kDa,PcaA4的分子量约为11 kDa。体外酶促反应结果表明,PcaA1A2、PcaA3和PcaA4是转化PCA必需蛋白,说明PCA 1,2-双加氧酶是IV型三组份双加氧酶。另外我们发现酶促反应中PcaA3可以被RedA2取代,同时P.putida KT2440含有可以供给PcaA1A2电子的电子传递链,且电子传递链蛋白与PcaA3和PcaA4的相似度小于10%。PCA 1,2-双加氧酶可以利用NADH和NADPH为电子供体,但使用NADH为电子供体时酶催化活性是使用NADPH的20倍。FPLC分析发现PcaA1A2的活性蛋白分子量为190 kDa,说明该酶是α_3β_3的组成结构。对PCA 1,2双加氧酶进行底物专一性分析发现,PCA 1,2-双加氧酶还可以转化邻羟基苯甲酸为邻苯二酚,但不能转化苯甲酸和2-OH-PCA。吩嗪(PHZ)是染料、药物和发色体等物质的合成前体,工业用量巨大,其对人体膀胱和肝细胞有一定的细胞毒性,有文献报道菌株S.yanoikuyae B1可以将吩嗪转化为1,2-二氢1,2-二羟基吩嗪,但还没确定负责降解的相关基因。首先对菌株B1的基因组进行了测序分析,拼接B1的基因组大小为5.7 M。接着用10个非可转移性持家基因的氨基酸序列构建了系统发育树。发现菌株B1与XLDN2-5的亲缘关系最近。有文献报道菌株B1中多环芳烃的加氢和羟基化由BphA1fA2fA3A4催化,因此我们将bphA1fA2fA3A4克隆到pBbB5a-RFP中以验证其能否催化吩嗪的降解。全细胞转化发现bphA1fA2fA3A4编码的联苯2,3双加氧酶可以催化PHZ的加氢和羟基化,形成1,2-二氢1,2-二羟基吩嗪。另外,我们发现1,2-二氢1,2-二羟基吩嗪不稳定,可以自发脱水形成2-OH-PHZ。克隆表达下游基因bphB和bphC发现,两个基因编码的蛋白不能将1,2-二氢1,2-二羟基吩嗪脱氢和开环,说明PHZ的降解通路与蒽的降解通路不同。另外,对bphA1f敲出和回补的实验表明bphA1fA2f是菌株B1中PHZ降解的唯一初始双加氧酶编码基因。本文以S.wittichii DP58和S.yanoikuyae B1为研究对象,找到了PCA和PHZ降解的初始双加氧酶,解析了PCA 1,2双加氧酶的组成和酶学特性,并预测和分析了PCA降解基因簇。本文的研究为后续PCA和PHZ降解通路和降解酶的研究打下良好的基础。
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图 1-1 典型的多环芳烃化合物和杂环芳烃化合物Figure 1-1 polycyclic aromatic hydrocarbons and heterocyclic aromatic hydrocarbons1.1.2 几种典型多环芳烃的降解通路微生物降解多环芳烃具有快速和环境友好等特点，其降解通路有一定相似性。首先在加氧酶的作用下使苯环羟基化，形成二氢二醇的结构，在脱氢酶的催化下形成二羟基多环芳烃，羟基化后的苯环电子变的活跃，接着在开环加氧酶的作用下完成开环，开环后的化合物在水解酶或醛缩酶的作用下脱去支链，经多次开环后多环芳烃被完全转化，最终进入核心代谢通路，为菌体生长提供能量。Gao 等收集了所有多环芳烃降解的通路，对其进行整理和归纳，目前已建立生物降解数据库(http://eawag-bbd.ethz.ch/index.html)，数据库中包括 219 个降解通路，1503个反应，1396 种化合物，993 个酶和 543 种微生物[2]。目前研究比较清楚的多环芳烃降解通路包括联苯、萘、芴等，多于 4 个苯环

图 1-2 萘降解途径Figure 1-2 Proposed catabolic pathways of naphthalene by bacteri机原料常用于医药、农药和染料的生产，，具有一定的环芳烃，上世纪 70 年代便分离出降解联苯的菌株 Sckia sp. B1）[3]。联苯在联苯双加氧酶（BphA1fA2fA-二氢 2,3-二羟基联苯，再经脱氢酶催化生成 2,3-二羟
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X592


本文编号：2630355