产絮菌合成生物絮凝剂特性及絮凝成分解析

发布时间：2020-04-19 03:03

【摘要】：城镇用水和工业废水处理中,生物下游工业及食品生产和发酵工艺中,絮凝过程是应用最普遍的关键环节之一,同时絮凝过程的研究趋势也由过去侧重工艺的优化逐渐发展为现在侧重药剂的开发。生物絮凝剂作为一种安全无毒、絮凝活性高、无二次污染的新型絮凝剂,对人类健康和环境保护都有很重要的现实意义。但是,目前大部分研究多处于实验室阶段,而且产量低且生产成本高,在很大程度上限制了生物絮凝剂的生产和应用。基于此,本课题通过对产絮凝菌的发酵动力学、生物絮凝剂的分离纯化、组成结构分析及合成代谢的研究,为生物絮凝剂的理论研究提供参考,也为生物絮凝剂的产业化提供技术保证。采用平板划线法对产絮性能退化的絮凝菌F2进行复壮,复壮后的产絮菌F2所产生物絮凝剂的絮凝效果已恢复至原始菌的95%以上,且生长旺盛,将其作为今后试验的出发菌株。采用三种方法对絮凝菌F2的生长进行测定,0-15h为指数生长期,15-24h为稳定期,24h后为衰亡期,其代时为44.1min。对絮凝菌F2发酵过程的溶解氧、pH值、菌体干重、生物絮凝剂活性成分含量、絮凝率、蛋白质、葡萄糖、总氮及总磷进行跟踪监测,并对发酵培养基进行优化,结果表明K2HPO4是发酵培养基中必不可少的,且用量不能少于5.0g/L,而KH2PO4则可以选择性的添加或不添加。根据絮凝菌F2发酵过程中菌体的生长、底物葡萄糖的消耗和絮凝活性物质合成变化,确定属于产物形成与细胞生长部分偶联型发酵。并基于Logistic方程和Luedeking-Priet方程建立了描述絮凝菌F2发酵过程中菌体生长、产物合成和底物消耗的动力学模型。经计算,三种模型均较准确的模拟了其过程。絮凝菌F2产生的生物絮凝剂大部分存在于胞外的培养液中,它是由微生物分泌到胞外的,其絮凝作用不是由菌体细胞产生的。生物絮凝剂具有一定的热稳定性,但随着pH值的变化絮凝活性波动较剧烈。同时对生物絮凝剂的化学性质进行了分析。以上结果都表明,生物絮凝剂中含有多糖和蛋白质类物质,其中多糖含量明显高于蛋白质含量,多糖与蛋白质含量比值为97.4: 2.2,且多糖为絮凝功能的主要承担者。利用有机溶剂对生物絮凝剂活性成分进行提取,确定了最佳提取条件为:浓缩倍数为1/2,乙醇浓度为100%,乙醇用量为1:2,沉淀时间为2h,沉淀pH值为6。经初步提取的生物絮凝剂中含有大量游离蛋白质,利用法对有机溶剂提取后的生物絮凝剂去除蛋白质,确定了最佳去除游离蛋白质条件为:V样品:Vsevage为2:3,V氯仿:V正丁醇为5:2,时间为30min。生物絮凝剂经初步分离提取后,蛋白质的含量显著降低。提取后得到的粗品溶解后呈淡黄色且较粘稠,絮凝活性有明显提高。根据生物絮凝剂的性质,选择了三种弱阴离子交换凝胶DEAE Sephadex A-25、DEAE Sepharose Fast Flow和DEAE-650M对生物絮凝剂粗品进行纯化预试验,从中选择出一种最适合纯化生物絮凝剂的离子交换凝胶DEAE-650M。对离子交换层析进行洗脱速度、收集量和上样量的选择,最终确定了离子交换层析纯化生物絮凝剂粗品的最佳条件为:DEAE-650M离子交换凝胶,2.6?20cm柱子,pH8.0 Tris-HCl起始缓冲液,0-1.5mol/LNaCl梯度洗脱,上样量为6mL,洗脱速度为54mL/h,收集量为3mL/管。絮凝菌F2产生的生物絮凝剂纯化物为白色棉絮状固体。经琼脂糖凝胶电泳检测,只有一条蓝色条带。其紫外吸收光谱显示,生物絮凝剂纯品中具有蛋白质和糖类特征基团,且不含核酸类大分子。生物絮凝剂纯品的HPLC为单一峰,采用GPC法测定分子量,不同已知分子量的多糖作标准,经计算分子量为1156,000Da。多糖的薄层层析、GC和GC-MS分析,均表明其主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成。红外光谱图表明其既含有蛋白质的特征基团氨基(或酰氨基),又含有糖的特征基团羧基和羟基,单糖为?-型吡喃糖。1HNMR说明生物絮凝剂活性中心多糖的每个重复单位中含有3个糖基单元,分别为α-吡喃型半乳糖、?-吡喃型甘露糖和α-吡喃型葡萄糖,它们的质量比约为1:3:5,它们以α和?糖苷键相连,化学式为[C54H108O54]n。根据生物絮凝剂的组成结构特点、絮凝菌F2对多种碳源和中间产物的利用情况,提出了一个絮凝菌F2合成生物絮凝剂途径的假设。
【图文】：

离子交换层析

第 2 章实验材料和方法①放走过量的溶液，让溶液的液面降低到恰好在柱床表面上面（即液面与树脂顶面相平）时，用长滴管吸取适量生物絮凝剂粗提溶液样品，沿绕色谱柱内壁小心地加入（千万不要使树脂床顶面收到样品液的冲击）。样品加完后，打开蠕动泵，使柱内溶液慢慢流出。待液面与树脂顶面接近相齐时，用长滴管吸取洗脱缓冲液（约 5-10mL）洗涤柱子的内壁，使样品都流入柱子内。重复 2-3 次，确保样品都流入柱子内，待液面与树脂顶面接近相齐时，关闭泵，在树脂顶部小心加入3-5mL 洗脱缓冲液。②连接柱子和梯度混合仪，调节适当的泵流速，分部收集器收集。(4) 检测每管中吸取 1mL 样品，按照苯酚-硫酸法逐管测定多糖的含量。(5) 树脂的再生分离结束后，用新鲜配制的 0.5-1.0mol/LNaCl 溶液洗脱。然后再用起始缓冲液平衡柱子后可再次加样分离。

絮凝菌,平板划线

发现F2菌株的絮凝活性有明显的下降，说明F2有退化倾向。于是采用纯种分离法中的平板划线分离方法对F2菌株进行分离纯化，使菌种絮凝活性得到恢复。复壮结果分别见图3-1，3-2，3-3和3-4。图3-1 絮凝菌F2平板划线分离Fig.3-1 Plate streaking of bioflocculant producing bacteria F2由图3-1可看到，絮凝菌F2经过48h的平板生长，，得到了若干单菌落。其菌落呈圆形，菌落直径较大，约2~3mm，颜色为乳白色，表面光滑，透明度差。为考察复壮后的絮凝菌F2的生长状况，将其单菌落首先接入到普通斜面培养基中进行培养
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：X703.5

【引证文献】