磷酸三苯酯的微生物降解机制及其降解产物毒性研究

发布时间：2020-04-19 20:23

【摘要】：有机磷酸酯阻燃剂(organophosphate flame retardants,OPFRs)是一类广泛使用的磷系阻燃剂,由于OPFRs容易被释放到环境中且具有毒性效应,对环境和人体健康构成了潜在威胁,近年来已受到人们的普遍关注。然而目前关于OPFRs的微生物降解性能和机制的研究还相对较少。本文以磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,TPHP)作为OPFRs的代表污染物,利用短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)为实验菌株,研究了B.brevis对TPHP的降解特性和转化机制以及菌体在TPHP胁迫下的蛋白表达变化,此外还分析了TPHP及其降解产物的细胞毒性效应和作用机理。主要研究结果如下:(1)B.brevis可以有效降解TPHP并且利用TPHP作为碳源和能源生长,菌体对TPHP的降解效果与投菌量,温度和体系pH值有关,当温度为30℃,pH值为7.0时,2 g/L的B.brevis在5 d内对TPHP(1 mg/L)的降解率达到92.1%,在此过程中降解体系的pH值也随时间增加逐渐降低。B.brevis对较低浓度(≤10 mg/L)的TPHP处理4 d后降解率可达80%以上,而高浓度(50 mg/L)的TPHP则会破坏菌体细胞正常的形态结构,造成细胞破损,导致其降解率仅为26.9%。利用B.brevis生物强化修复河水体系中的TPHP,显著减少了TPHP降解过程的迟滞期,处理96 h后TPHP的降解率达到97.9%。这些结果表明生物强化可以作为一种原位修复TPHP污染水体的潜在方案。(2)在B.brevis降解TPHP的过程中,利用LC-Q-TOF-MS高分辨质谱共检测到7种TPHP的代谢产物,包括DPHP,PHP,单羟基TPHP,单羟基DPHP,单羟基PHP,双羟基TPHP和双羟基DPHP。根据代谢产物推测TPHP的降解途径,主要涉及水解和羟基化过程。DPHP和PHP的含量随着TPHP的降解逐渐累积,反应5 d内最高浓度分别达到77.1和2.1μg/L。此外B.brevis对1 mg/L的DPHP和PHP也具有一定的降解效果,处理5 d后最高降解率分别为14.4%和23.3%。B.brevis在TPHP的胁迫下引发氧化应激反应,导致细胞内MDA含量升高,同时诱导SOD和CAT活性增大。细胞色素P450酶抑制剂胡椒基丁醚显著抑制了B.brevis对TPHP的降解效果以及菌体P450酶基因的表达,并且这种抑制作用随胡椒基丁醚浓度的增加而增强,表明P450酶可能参与了TPHP的生物降解过程。(3)基于同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)分析B.brevis在TPHP暴露下的蛋白表达差异,其中有102个蛋白表达上调,80个蛋白表达下调。这些差异蛋白的功能主要集中于运输与代谢,信息存储与处理,细胞过程与信号等。TPHP刺激了B.brevis的碳水化合物代谢,导致参与糖酵解过程的蛋白表达出现了上调,同时TPHP还通过增强菌体的氨基酸和脂质代谢过程,为细胞的生长代谢活动提供更多的能量。参与装配50S和30S亚基的核糖体蛋白在TPHP的暴露下表达显著上调,对于菌体细胞蛋白质的合成具有重要作用。ABC转运蛋白和抗氧化应激蛋白在TPHP胁迫下也表现出不同的表达水平。B.brevis在环境压力下通过调控不同功能蛋白的表达维持了细胞内环境的稳定同时增强了菌体对TPHP的适应性。(4)TPHP及其降解产物DPHP和PHP均对HepG2细胞的活力产生了不同程度的抑制作用,其中TPHP的抑制效果最强,PHP最弱。TPHP暴露浓度增大可以导致细胞内Ca~(2+)含量显著增加,破坏了线粒体膜的完整性促使ROS在细胞内积蓄,引起了细胞氧化应激,进一步造成细胞线粒体膜电位下降,从而诱导HepG2细胞凋亡。高浓度(≥100μmol/L)的TPHP还会导致细胞核损伤固缩。DPHP和PHP对细胞凋亡的诱导作用相比TPHP要明显减弱。此外,TPHP能使HepG2细胞周期阻滞于G0/G1期,减少了S期细胞的比例。与DPHP和PHP相比,TPHP对HepG2细胞的毒性效应最强,DPHP次之,且具有一定的剂量-时间效应关系。结果表明TPHP及其降解产物对HepG2细胞的毒性与调控细胞周期进程和线粒体途径介导的细胞凋亡有关。总的来说,生物降解消减了TPHP的毒性作用,是一种有效和安全的TPHP污染修复方法。本研究有助于从蛋白水平和毒理学角度揭示微生物降解转化TPHP的机制,以及TPHP及其降解产物可能对环境和人体健康产生的毒害作用,为开发OPFRs污染的微生物修复技术提供了数据支持。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X592;X171.5

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