根癌农杆菌GW4砷氧化与砷趋化的关联及AioR的调控功能

发布时间：2020-04-22 06:38

【摘要】：砷(Arsenic,As)是一种广泛存在于自然界中的类金属,最常见的两种形态为亚砷酸盐[Arsenite,As(III)]和砷酸盐[Arsenate,As(V)]。砷氧化细菌的砷氧化酶(Aio BA)催化高毒性的As(III)氧化成低毒性的As(V),而aio BA的表达受到三组份调控系统Aio XSR的调控,其中AioR为转录调控蛋白。目前发现一些砷氧化细菌可以利用砷氧化产生的能量促进生长,且具有趋向于As(III)的现象,但As(III)趋化的受体蛋白还未被鉴定,且As(III)趋化的机制尚不清楚。此外,加砷促长的异养砷氧化细菌砷氧化影响的代谢路径以及AioR是否可以调控其他代谢路径也尚不清晰。本研究以一株分离自砷污染的地下水沉积物中的砷氧化型根癌农杆菌GW4为研究对象,该细菌具有极高的As(III)抗性,且同时具有加砷促长和趋向于As(III)的表型。我们在细菌GW4基因组中共找到20个甲基趋化受体基因mcp,其中1个mcp位于砷基因岛中。该mcp基因及其他趋化基因(che A、che Y2与fli G)受到As(III)的诱导,且通过MEME网站在mcp启动子区发现了AioR的结合位点。通过毛细管趋化实验发现,野生株在0.5 mmol/L 2 mmol/L浓度下具有趋向于As(III)的表型,而缺失mcp或aio R基因后细菌丧失了对As(III)的趋化能力,互补株表型得到了回复,该结果表明mcp及aio R基因是细菌As(III)趋化必须的。通过色氨酸荧光光谱法发现Mcp周质感应区可以特异性的结合As(III),但不可以结合As(V)。以上结果表明我们鉴定到了首个As(III)趋化受体蛋白。通过lac Z报告基因实验发现mcp基因在aio R突变株中不再受到As(III)的诱导。通过细菌单杂交实验和凝胶迁移率实验(EMSA)证明了AioR可以结合在mcp基因的启动子区从而激活mcp的表达,且通过DNA足迹法最终确定了AioR的精确结合位点。此外,我们发现mcp的缺失使细菌GW4加砷促长的现象消失,且砷氧化效率及As(III)抗性均降低。通过以上结果我们推测,Mcp参与了细菌的砷氧化,AioR同时调控细菌砷氧化酶Aio BA和As(III)甲基趋化蛋白Mcp的活性,砷氧化和砷趋化可能是相互促进的关系(图A)。在发现AioR可以调控砷氧化和砷趋化以后,我们联想AioR是否还可能调控其他代谢路径,因此我们通过i TRAQ蛋白质组学的方法分析了以下4组差异蛋白:GW4(+As III)/GW4(-As III)、GW4-?aio R(+As III)/GW4-?aio R(-As III)、GW4-?aio R(-As III)/GW4(-As III)和GW4-?aio R(+As III)/GW4(+As III),其中每一组最终分别鉴定到41、71、82和168个差异蛋白。通过EMSA和荧光定量PCR在GW4菌中一共鉴定出了12个启动子具有AioR结合位点的基因,结合差异蛋白质组学结果及荧光定量PCR结果我们得出以下结论:1.AioR主要调控细菌的砷氧化,但可以同时调控其他与砷氧化相关的代谢通路;2.AioR通过调控细菌磷酸盐转运系统(Pst/Pho)从而使细菌可以更加经济有效的利用磷酸盐(Pi),从而弥补磷酸盐(Pi)的匮乏;3.AioR可以调控砷抗性基因(ars C、acr3)、肽聚糖再生基因anm K、脯氨酸合成基因pro C和修复蛋白基因PIMT,从而赋予细菌GW4高砷抗性;4.AioR可以调控TCA循环,从而使细菌以砷氧化为主要产能途径(图B)。综上所述,本研究鉴定到了首个As(III)趋化受体蛋白Mcp,并证明AioR可以调控细菌对As(III)的趋化和氧化,砷趋化和砷氧化密切相关。此外,本研究首次报道了加砷促长的异养砷氧化细菌的代谢路径,并证明出AioR是砷氧化的主要调控蛋白,该蛋白同时也可以调控与砷抗性相关的代谢途径中的一些基因的表达。该论文的结果加深了我们对细菌砷氧化机制的认识,具有重要科学价值。
【图文】：

图 1.2 双组份调控系统的分类 (Groisman et al 2016)Fig. 1.2 Classes of two-component signal transduction systems (Groisman et al 2016)

图 1.3 本研究分析的细菌砷基因岛的基因排布的三种类型Fig. 1.3 Three of gene and operon arrangement of arsenic gene island in this study对于 GroupI 及 GroupII 的砷氧化细菌，细菌的砷氧化是受到三组份调控系统
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X703;X172

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本文编号：2636263