微生物—蓖麻联合修复铜污染土壤的机理与应用研究

发布时间：2020-04-30 02:55

【摘要】：20世纪以来,国内外不断发生严重的土壤重金属污染事件,不仅造成了人体健康的严重伤害和巨大的经济损失,也给生态环境带来了严重的破坏。针对土壤重金属对人体和动植物危害的长期性、隐蔽性、不可逆性及循环过程中难以被降解的特点,人们先后发明了物理修复、化学修复和生物修复等技术。生物修复技术利用植物、微生物等对重金属的生物富集作用修复受污染的土壤。生物修复尤其是基于超富集植物的植物修复技术,由于具有原位修复、不破坏场地结构、费用低廉以及适合大规模工程应用等优势,一经提出就被国际上列入最有前途的重金属污染土壤治理技术,引起了研究人员的极大兴趣。然而,由于已发现的超富集植物存在生长量较小或重金属富集能力有限等不足,植物修复的效率仍然有待进一步提高。除了寻找和筛选生物量大、重金属富集能力强的野生植物资源外,个有效的途径是通过向土壤中添加化学强化剂、微生物菌剂或肥料,增强植物对重金属的富集、提取,其中以添加微生物的环境风险和经济成本较小。因此,植物—微生物联合修复已经成为重金属污染修复技术研究的重点。Cu是生命必需的营养元素,但过量的Cu会对人体和动植物产生严重的危害。在我国重金属污染严重的土壤中,Cu是重要的污染元素之一,由于多种原因,大多数未得到有效的治理。筛选Cu耐性植物和微生物资源,研究植物-微生物联合修复Cu污染土壤的修复技术,对于丰富生物修复理论,加强生态环境建设具有重要的理论和实践意义。本文以湖北大冶铜绿山铜铁矿废弃地土壤及其生长的蓖麻为研究对象,结合野外调查、水培、盆栽等培养方法,并借助原子吸收分光光度法、透射电镜和红外光谱分析等先进技术,探讨了蓖麻对土壤Cu的积累特性及其富集机理；从蓖麻根际土壤中分离、鉴定Cu耐性微生物,并采用原子吸收分光光度法、等温吸附模型及吸附动力学、红外光谱分析和差异蛋白分析等技术,探讨了高耐Cu菌株TLSB3-K对Cu的吸附及耐性机理。在此基础上,通过盆栽试验,探讨添加TLSB-3菌液对蓖麻修复Cu污染土壤的强化作用。研究内容主要包括：(1)大冶铜绿山野生蓖麻Cu富集特性及其植物修复潜力研究;(2)Cu在蓖麻根细胞的分布和化学形态研究；(3)Cu胁迫对蓖麻根有机酸分泌及根际土壤酶活性的影响；(4)蓖麻根际土壤耐Cu微生物的分离鉴定；(5)高耐Cu菌株筛选及其吸附动力学研究；(6)耐Cu菌株TLSB3-K蛋白质差异分析；(7)耐铜菌株TLSB3-K对蓖麻修复铜污染土壤的增强效果。通过上述研究,取得了如下研究结论：1、野外调查结合分析测试结果表明,大冶铜绿山矿区蓖麻根际土壤受Cu、Cd、Pb、Zn和Cr等多种重金属元素的复合污染,其中土壤Cu、Cd含量为2075.30 mg/kg和432mg/kg,达到重度污染等级。土壤Cu为该区域的特征污染元素。蓖麻体内含有Cu、Zn、 Pb、Cd等多种重金属元素,其中以Cu含量最高,植株平均Cu含量为2019.04 mg/kg (DW,下同),其中地上部Cu含量为761.12 mg/kg,根部平均Cu含量1257.92 mg/kg,根部是蓖麻积累Cu的主要器官。实验结果表明,蓖麻不仅能能够在Cu污染严重的土壤正常生长,而且体内能够富集较多的Cu,表现出较强的Cu耐性,在植物修复Cu污染土地上具有较大的潜力。实验同时证实,虽然蓖麻植株Cu含量很高,但其种子并未受到Cu的毒害,蓖麻种皮、胚和胚乳的Cu含量都处在正常水平。2、营养液条件下,蓖麻对Cu也具有较强的耐性。Cu浓度为40 mg/kg时,蓖麻幼苗生长正常,其生长速率和生物量指数最大：Cu浓度为60 mg/kg时植株Cu含量最大,达到16570.12 mg/kg,其中根部积累的Cu占植株总量的91.31%。化学浸提结果显示,Cu在蓖麻根细胞内以不同的化学形态存在,67.66%的Cu结合在细胞壁的可交换酸性极性化合物、极性化合物纤维素、木质素的结构团和蛋白质、果胶等组分上,细胞质和细胞核中结合的Cu相对较少；透射电镜观察可见蓖麻根细胞壁变厚,胞壁上附有大量高密度电子体；红外光谱分析显示,Cu主要结合在根细胞壁上的酸性极性化合物和纤维素、半纤维素、多糖的羧基、羟基官能团,以及蛋白质氨基官能团上。根细胞壁在蓖麻忍耐和解除Cu毒可能起到重要作用。3、人工配土盆栽试验表明,蓖麻根分泌物中含有草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸和酒石酸等有机酸,其中草酸和苹果酸的含量占有机酸总量的71.47%；土壤Cu浓度 300 mg/kg时,促进酒石酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸的分泌；土壤Cu浓度 300 mg/kg时,对有机酸分泌起抑制作用。虽然Cu胁迫对草酸分泌起抑制作用,但其绝对含量始终高于其它有机酸。统计分析结果显示,根分泌的草酸、苹果酸与蓖麻植株Cu含量间达到极显著线性正相关水平,乳酸与植株Cu含量间达到显著线性正相关水平。草酸、苹果酸和乳酸可能对蓖麻Cu吸收起到促进作用。4、人工配土条件下,Cu胁迫对土壤酸性磷酸酶表现为激活作用,并且随着土壤Cu浓度的增加酶活性逐渐增强,土壤Cu浓为900 mg/kg时,酶活性增加了118.63%;Cu胁迫对土壤脲酶、土壤过氧化氢酶和土壤蔗糖酶起抑制作用,抑制强度大小为土壤蔗糖酶土壤土壤脲酶土壤过氧化氢酶,土壤Cu浓度为900 mg/kg时,酶活性分别降低了61.0%、21.62%和19.60%。统计分析结果显示,土壤过氧化氢酶和土壤蔗糖酶与植株Cu含量间达到极显著线性负相关,土壤酸性磷酸酶酶与植株Cu含量间达到极显著线性正相关。土壤磷酸酶可能在蓖麻根系吸收和转运Cu的过程中起到重要的促进作用。5、从蓖麻根际土壤中分离的微生物菌株中,经低Cu胁迫筛选出5株细菌和5株真菌。对5株细菌进行形态比较、革兰氏染色和16SrDNA序列比对,鉴定为4个属4个种,分别是寡养单胞菌属的嗜麦芽寡养单胞菌(S. maltophilia)、芽孢杆菌属的蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、不动杆菌属的醋酸钙不动杆菌(A. calcoaceticus)和假单胞菌属的恶臭假单胞菌(P.putida);对5株真菌进行形态观察和18SrDNA-ITS序列测定,鉴定3个属5个种,分别是青霉属的马尔尼菲青霉菌(P. marneffei)、曲霉属的黑曲霉(A. niger)、黄柄曲霉(A. flavipes)和杂色曲霉(A. versicolor)和镰刀菌属的尖孢镰刀菌(F. oxysporum)。6、对蓖麻根际土壤中分离出的10个菌株进行复筛和Cu驯化培养结果表明,细菌菌株TLSB3-K对Cu的耐性最强,具有用于Cu污染土壤修复的潜力。菌株TLSB3-K的最适培养基为牛肉膏蛋白胨培养基,最佳pH是6.5,最适生长温度为32-36℃,最佳渗透压(NaCl%)为1.3%。Cu浓度小于300 mg/L时,对菌体生长影响较小,其生长曲线和最大OD值与对照基本保持一致；Cu浓度为500mg/L时,菌体生长受到一定的抑制,其生长曲线和最大OD值稍低于对照；当Cu浓度增加到700 mg/L时,Cu对菌体的抑制作用明显,生长的延滞期明显延长,且衰亡期提前。7、菌株TLSB3-K对Cu具有较强的吸附能力,吸附量和去除率受不同初始Cu浓度影响较大。初始Cu浓度在100～400mg/L范围内,菌体对Cu的吸附量和去除率随着Cu浓度的上升而增加,最大吸附量与最高去除率分别为148.32 mg/g和15.54%;初始Cu浓度在大于400 mg/L,菌体对Cu的吸附量和去除率随着Cu浓度的上升而逐渐下降,Cu浓度为700 mg/L时,吸附量下降到52.08 mg/g,去除率仅为3.22%。分别用Langmuir和Freundlich等温吸附模型对实验结果进行拟合,Langmuir方程的相关系数为0.9230, Freundlich方程的相关系数为0.9874,表明用Freundlich方程模拟菌株TLSB3-K对Cu的吸附过程更为合适。根据Elovich方程,在Cu浓度400 mg/L条件下进行时间吸附动力学拟合,菌株TLSB3-K对Cu的吸附初期上升迅速,1h后趋于平稳,4h后逐渐达到平衡状态,表明菌株TLSB3-K对Cu的吸附除了细胞表面吸附外,还包括向胞内的转移和积累作用。并且通过FTIR结果证实,Cu主要结合在菌体细胞壁多糖和蛋白质的羟基、羧基、酰胺基和磷酰基团上。8、分别提取菌株TLSB3-K的驯化株和对照未驯化株的总蛋白,进行2-DE电泳及凝胶图谱分析,获得表达量有显著性差异(p0.05)蛋白点52个,主要分布在pH4-9的范围内。与对照组相比,Cu驯化菌株表达量上调蛋白点的有9个,下调蛋白点的有31个,消失的蛋白点有12个。其中,上调差异点783号的相对丰度增加3.5356倍,表明该蛋白点对应的蛋白或多肽具有较强的Cu诱导特性；下调差异点中,编号413、540、508和653的相对丰度分别减少3.16567、4.64262、5.23367和5.55374倍,表明这些差异点可能对Cu处理较为敏感。取9个上调蛋白点和20个下调蛋白点(max1.5)进行Maldi-TOF-TOF分析,成功鉴定出17个蛋白点,其中87.5%的上调蛋白为参与能量代谢、抗氧化和外源性物质防御蛋白质,41%的下调蛋白为参与蛋白质和氨基酸代谢相关蛋白质。因此,菌株TLSB3-K对Cu胁迫存在主动防御过程,主要是通过表达抗氧化酶(物)和铜抗性蛋白增强对Cu的耐性。9、用采自大冶铜绿山采矿废弃地的Cu污染进行盆栽修复实验,研究向盆土中添加耐Cu菌株TLSB3-K对蓖麻修复Cu污染土壤的增强效果。结果表明,加菌促进蓖麻生物量的增加和叶绿素的生成。加菌茎叶和根的生物量分别比对照增加了22.55%和17.82。叶绿素a占叶绿素总量的70%,是蓖麻的主要光合色素。加菌对蓖麻根抗氧化酶SOD、POD具有明显的激活作用,作用强度随着盆栽时间逐渐减弱；加菌对CAT活性的影响表现为前期抑制、后期激活的特点。加菌对蓖麻根系分泌苹果酸、草酸和酒石酸具有明显的促进作用。苹果酸的促进作用随着盆栽时间的延长而逐渐增强,草酸和酒石酸分泌的促进作用表现为前期上升、后期下降的趋势。加菌对过氧化氢酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性的影响都表现为前期激活、后期抑制的特点；加菌对脲酶起激活作用,但强度逐渐减弱。加菌对蓖麻Cu积累具有明显的增效作用,加菌后植株Cu含量比对照高出25.70%,显示出较好的增强效果。
【学位授予单位】：中国地质大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X53

【参考文献】