一株氟磺胺草醚降解菌株BY-1的分离鉴定、降解特性及应用研究

发布时间：2020-05-05 09:17

【摘要】：氟磺胺草醚是一种大豆、花生苗后除草剂,能有效防除大豆、花生田阔叶杂草,对禾本科杂草也有一定防效。但该农药在土壤中不易降解,残留期比较长,易对后茬敏感作物造成伤害,造成经济损失并影响种植业结构的调整。本文从长期受氟磺胺草醚污染的农田土壤中分离筛选到一株氟磺胺草醚降解菌BY-1。16S rRNA基因序列测定与分析结果表明,菌株BY-1与假单胞菌属的Pseudomonas luteola IAM 13000T(99.5%)和Pseudomonas duriflava HR2T(97.3%)亲缘关系最近且形成一个分支,它与该属其它模式菌株的相似度为均小于97.0%。Pseudomonas sp.BY-1与Pseudomonas luteola IAM 13000T和Pseudomonas duriflava HR2T的DNA-DNA同源性分别为28.9±3.1%和21.0± 1.5%。菌株BY-1为革兰氏阴性,好氧,无芽孢,有数根极生鞭毛。菌体短杆状,长2.8-3.2μm,宽0.6-0.8μm。在TSA琼脂培养基上能够形成直径1-2mm的菌落:黄色、不透明、表面光滑、菌落中央突起、边缘规则、无晕圈、无色素产生。该菌株主要脂肪酸为18:1 w7c(39.4%),16:0(21.9%),Summed Feature3(17.7%)。主要的呼吸醌是Q-9。主要极性脂为双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)。基因组DNAG+Cmol%含量为55.3%。经鉴定,菌株BY-1为假单胞菌属Pseudomonas sp.的一个新种,命名为泽澍假单胞菌Pseudomonas zeshuii sp.nov.BY-1T(= KACC 15471T= ACCC 05688T)。BY-1菌株能以氟磺胺草醚为唯一碳源生长,在72 h对50 mg·L-1氟磺胺草醚降解率达到88.7%。降解效果随着氟磺胺草醚浓度的升高而降低。BY-1菌株降解氟磺胺草醚的最适温度为30℃,最适pH为7.0。添加Ca2+和Fe3+对菌株BY-1降解氟磺胺草醚均有促进作用,但Co2+、Mn2+和Cu2+则有抑制作用。研究结果表明氟磺胺草醚降解酶属于组成酶,不需要氟磺胺草醚的诱导,主要存在于细胞膜内。BY-1菌株氟磺胺草醚降解酶的最佳反应条件为pH7.0,温度30℃,5mL反应体系中添加50μL粗酶液,反应时间为60 min。采用HPLC-MS质谱技术检测到BY-1菌株降解氟磺胺草醚过程中存在5个降解产物,鉴定了降解产物的结构式,并推测出BY-1菌株降解氟磺胺草醚降解途径。首先C-S键的断裂,从而脱去磺酰基上的甲基,苯环上C-F和C-C1键的断裂,脱去一个氟离子和氯离子。然后苯环上的硝基还原成氨基后再乙酰化,随后S-N键断裂,脱去甲磺酰基,最后生成物为5-[4-(二氟甲基)苯氧基]-2-(乙酰胺基)苯甲酰胺。接种降解菌株BY-1对于50 mg.kg-1 土壤的氟磺胺草醚30d降解率达到73.4%。BY-1菌株对土壤中氟磺胺草醚的降解率受到土壤温度和土壤含水量等因素的影响,在土壤pH7,温度30℃,含水量20%-30%时其对土壤中氟磺胺草醚降解效果好。构建了具有具有荧光标记的BY-1pTR菌株,检验了其在土壤中的存活。氟磺胺草醚的使用对土壤中主要可培养微生物种群有一定的影响。通过DGGE分析,发现投加降解菌株BY-1后,对受氟磺胺草醚污染的土壤的微生物种群起到了一定的修复作用。盆钵实验表明,投加BY-1菌株后可在一定程度上缓解氟磺胺草醚对玉米的药害。氟磺胺草醚的使用抑制土壤中脱氢酶和蔗糖酶的活性,对土壤中过氧化氢酶、脲酶和多酚氧化酶则呈现先激活后抑制的波动作用。降解菌株BY-1的加入可以部分缓解氟磺胺草醚对土壤中各种酶活性的影响,使其接近正常水平。
【图文】：

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逑ｒＲＮＡ基因的通用引物进行ＰＣＲ扩增（Ｗａｎｇ等，２０１０），分别得到长度约１．５邋ｋｂ的片逡逑段（图１－４）。将ＰＣＲ产物和ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转化至￡．ｏ？／／ＤＨ５ａ中，将阳性克逡逑隆测序，将阳性克隆测序，测序结果提交至ＮＣＢＩ数据库，获得登录号为ＪＮ４１１０９３。逡逑将菌株的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列在ＧｅｎＢａｎｋ中及ＥｚＴａｘｏｎ邋ｓｅｒｖｅｒ邋２．１数据逡逑（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｚｔａｘｏｎ．ｏｒｇ／；邋Ｃｈｕｎ邋等，２００７）进行邋Ｂｌａｓｔ邋比对，根据比对结果用邋ＭＥＧＡ逡逑ｖｅｒｓｉｏｎ邋５．０邋（Ｔａｍｕｒａ邋等，２０１１）软件包中的邋Ｋｉｍｕｒａ－Ｐａｒａｍｅｔｅｒ邋Ｄｉｓｔａｎｃｅ邋模型计算进化逡逑距离（Ｋｉｍｕｒａ，１９８０邋），并分别用邋Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ邋（邋Ｓａｉｔｏｕ邋等，１９８７邋），，逡逑ｍａｘｉｍｕｍ－ｐａｒｓｉｍｏｎｙ邋（Ｅｃｋ邋等，１９６６；邋Ｆｉｔｃｈ邋等，１９７１）邋，邋ｍｉｎｉｍｕｍ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋（Ｒｚｈｅｔｓｋｙ逡逑等，１９９２）和邋ｍａｘｉｍｕｍ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ邋（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ邋等邋１９８１）构建系统发育树（图邋１－５）。逡逑从发育树中可以看出，菌株ＢＹ－１与两个模式种／攸士邋ＩＡＭ逡逑１３０００Ｔ（Ｋｅｎｔａｒｏ邋等

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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X592;X172

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