原油降解真菌分离和降解及芳香烃降解基因的转录谱分析

发布时间：2020-05-18 07:09

【摘要】：石油作为能源被广泛利用,但在石油开采、运输及生产过程中对土壤环境产生的污染也是严重困扰人类的问题。污油的处理方法很多,包括物理、化学和生物等修复方法,其中生物修复以安全、经济,无二次污染等优点备受关注。但原油中组分复杂,污染土壤的生物修复难度也很大,尤其是石油中的芳香烃类成分更难被微生物所利用,因此,分离筛选原油降解微生物,研究其对原油组分的代谢特点,并采用转录组测序技术探讨原油降解真菌的芳香烃降解相关基因表达,为今后芳香烃高效降解菌的筛选和开发提供技术支持,从而进一步提高原油污染的生物修复效率。本研究从大庆油田地区长期油污土壤中分离得到了12株高效的原油降解真菌,通过菌落形态、菌丝形态、生理生化实验及ITS序列对已分离真菌进行了鉴定,确定其近缘种属：H1、H3、H9、X9与X12属于镰刀菌属(Fusarium sp.);H2属于土曲霉(Aspergillus terreus), H4属于雅致放射毛霉(Actinomucor elegans),X1属于植物内生菌(Fungal endophyte), X3属于真菌菌株(Fungal sp.), X7属于黄白生丛赤壳菌(Bionectria ochroleuca), X11属于葡萄穗酶菌(Stachybotrys sp.),D4属于木霉菌(Trichoderma atroviride)。在液体培养条件下研究了pH、氮源和磷源对12种真菌菌丝干重的影响,结果发现12种原油降解真菌均在pH7.0时生长旺盛,获得较高的菌丝干重,H9和X12真菌在以NH4NO3为氮源时生物量最高,H4真菌的最适氮源为NaNO3,其余9种原油降解真菌均以KNO3为氮源时达到最大平均菌丝干重。KH2PO4和K2HPO4/KH2PO4(1:2)双磷源都能使12种真菌具有较高的生物量,且两种磷源对菌丝生长影响不显著。影响真菌原油降解率的因素有很多,本文主要探讨了培养条件、pH、N/P比值、NaCl浓度和原油浓度对12种原油降解真菌原油降解率的影响。总体来说,当pH、N/P比值、NaCl浓度确定时,真菌在液体培养条件下的原油降解率普遍高于土壤中的原油降解率。在pH7.0时多数真菌表现为最高降解率,在pH8.0～9.0时真菌也能维持较高的降解率。同时12种真菌的原油降解率随NaCl浓度的升高而降低,但NaCl浓度为10%时X9和D4菌株还有20%以上的原油降解率,可以看出从大庆油污土壤中分离的原油降解真菌具有一定的耐盐碱性,这与菌种对大庆地区的盐碱土壤特质的适应性是相符的。12种真菌菌株中X1菌株在液体培养和土壤培养中都显示出了最高的原油降解率。真菌对石油烃类物质的降解代谢多数是从单加氧开始的,但在代谢过程中不同的菌种有多种复杂的酶系参与,本文对12种原油降解真菌在1%原油浓度下几种主要降解相关氧化还原酶活性进行研究,探讨真菌在原油降解过程中木质素过氧化物酶(Ligin Peroxidase,LiP)、锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)和漆酶(Laccases,Lac)活力与原油降解率之间的关系。结果发现,各菌株产酶种类和活力各不相同,除X12的LiP和H4的Lac的活性受原油的抑制外其余菌株的酶活性都能够在原油的诱导下显著升高。Lac的活性与真菌土壤条件原油降解率呈现极显著正相关性；LiP活性与液体和土壤培养条件下原油降解率之间的相关系数均小于0.3；而MnP活性与原油降解率之间呈现负相关。通过对能够降解芳香烃的X1菌株的转录组测序、过滤和拼接后得到了34003个转录本,即Unigene,并在Nt、Nr、GO等7个数据库中成功注释了28660个基因片段。GO分类显示与烷烃代谢相关的酶基因共16376个,其中在GO功能注释中功能为氧化还原酶作用于CH-CH、氧化还原酶作用于双酚及相关物质、氧化还原酶作用于CH-OH、转移酶作用于酰基、转移酶作用于烷基或芳基、碳-碳裂解的酶基因数量都相对较多。KEGG Pathway富集结果显示X1菌株的基因集中在碳水化合物代谢途径中的最多,有527个,占被注释的基因总数的12.3%,并且其中细胞芳香化合物代谢和杂环代谢途径中的基因数量显著高于其他代谢途径中的基因数量。比较X1菌株在含茚的无机盐培养基处理和PDA培养基非处理对照的基因表达水平,发现1216个上调基因中,在萘降解通路和氧化磷酸化通路中上调基因的比例最高,结合GO分类中比例较高的酶基因,预测茚的代谢可能与萘的代谢有极相似的过程。
【图文】：

致突变,烃类物质,芳香烃,环境监测

图1-1大庆落地原油污染Figure 1-1 Crude oil pollution landing in Daqing许多研究表明，石油中含有大量的烃类物质，包括q<烃和芳香烃，尤其是其中的芳经(PAHs),具有很强的毒性，是典型致癌、致畸、致突变的“三致”成分，世生组织早已把16种PAHs作为环境监测的重要对象，这些高分子量的复杂有机化

真菌基因,比值

采用CTAB法对12种真菌的菌丝进行基因组DNA的提取，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2-3，12个真菌的基因组DNA样品电泳条带清晰、明亮，但点样孔处较墜，可能存在蛋曰质等杂质，但经过OD260和OD28G的测定（表2-7)，OD26()/OD280比值均在1.8?2.2之间，OD260/OD230比值在2.0?2.4之间，，表明DNA的纯度较好，含有的-19-
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X172;X53

【参考文献】