聚－3－羟基丁酸降解菌的选育及其解聚酶的研究

发布时间：2020-05-20 20:52

【摘要】：在本文的研究中，从自然界中分离获得了一株具有降解聚-3-羟基丁酸[poly(3-hydroxybutyrate)，PHB]能力的菌株，通过对菌落的形态观察、生理生化特性分析和16SrDNA的比对，发现该菌株与门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina16SrDNA有100%的相似度，因此将该菌株命名为Pseudomonas mendocinaDSWY0601。该菌可以在PHB为唯一碳源的培养基上形成明显的透明圈，也可以通过液体培养侵蚀PHB薄膜，使PHB薄膜逐渐被分裂破坏，最终将PHB薄膜降解为水溶性的3-羟基丁酸。根据单因素试验和正交试验对P. mendocina DSWY0601菌株的培养基和培养条件进行了优化，如碳源、氮源、磷源、pH、培养温度、培养时间、摇床转速和装液量等。优化出的最佳产酶条件如下：培养基的碳含量为0.15%；氮含量为0.15%；磷含量为0.554%KH_2PO_4/1.194%Na_2HPO_4·12H_2O；培养温度为35°C；培养基初始pH为8.5；培养时间为36h；摇床的转速为200r/min。通过离心、超滤、DEAE-Sepharose fast flow column和Phenyl Sepharose6fast flowcolumn等步骤纯化出一个胞外PHB解聚酶，纯化倍数为4.2，回收率为5.7%。通过SDS-PAGE蛋白电泳测得PHB解聚酶的分子量约为59.8kDa。该酶的最适反应温度和pH分别为50°C和8.5，在温度20~50°C和pH8.0~9.0范围内酶的稳定性最好。Mn~(2+0和Fe~(2+)对PHB解聚酶酶活力有轻微的抑制作用，而PMSF、H_2O_2和SDS对PHB解聚酶的酶活力有强烈的抑制作用，Tween20和Triton X-100对酶活力不存在明显的抑制作用。PHB解聚酶的Km为0.172mg/mL。在底物特异性方面，，PHB解聚酶具有酯酶活性，而且除可以降解PHB外，还可以降解聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)和3-羟基-4羟基脂肪酸共聚酯(P3/4HB)，但对聚乳酸(PLA)、聚已内酯(PCL)及聚丁烯琥珀酸酯(PBS)没有降解活性。PHB解聚酶降解PHB的主要产物为3-羟基丁酸，推测该解聚酶降解PHB的模式是一种外切酶的方式，每次都从端链切下一个3-羟基丁酸。 PHB解聚酶肽指纹图谱的分析结果显示该解聚酶与P. mendocina ymp基因组中预测的PHB解聚酶相似性较高。根据相关序列设计引物，克隆了来源于P. mendocinaDSWY0601的PHB解聚酶基因(phaZpm)，并通过诱导表达和Ni柱纯化获得了重组的PHB解聚酶。纯化的重组PHB解聚酶分子量约为62.1kDa，最适反应pH和温度分别为8.5和50°C。同时对PHB解聚酶基因进行了序列分析，推测该酶的576个氨基酸序列中，含有一个位于N端由39个氨基酸残基组成的信号肽，一个催化结构域，一个连接区和两个C端的底物结合结构域；在催化结构域中，包含有酯酶保守的五肽box和催化三联体结构。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X172

【参考文献】