药物类污染对斑马鱼胚胎形态、行为和基因表达的生态毒理效应研究

发布时间：2020-05-22 15:07

【摘要】：随着经济发展和人们生活水平的不断提高,越来越多的药物及个人护理品类化合物(PPCPs)被人们用于日常生活。研究指出,这类物质摄入后会有大约50-90%被排出体外,而常见的污水处理技术分解能力有限,剩余的PPCPs会通过污水处理厂排水进入环境。PPCPs的药物机理又使其具有许多特殊的毒性效应,因而PPCPs污染正在受到人们越来越多的关注。长江河口区域毗邻上海市,是中国人口最密集,工商业最发达的地区之一。上海市的污水主要向长江河口区域近岸水体排放,这就造成了PPCPs在长江河口近岸水体的持续输入。在众多的PPCPs污染物中,一些常用物质的环境浓度已经达到了较高的水平。鉴于可能存在的环境风险,有必要针对该区域一些典型的PPCPs污染物展开毒理学调查研究。基于已有数据和文献报道,本研究选择了他莫昔芬(TAM)、双酚A(BPA)、布洛芬(IBP)、双氯芬酸(DCF)和对乙酰氨基酚(PRCT)这五种常见的PPCPs作为调查的目标化合物。本研究首先利用斑马鱼胚胎/幼鱼96小时急性毒性暴露实验作为研究方法,从形态学、行为学和分子生物学等角度,调查了这些污染物的毒性效应。同时,本研究以上述实验结果为基础,筛选了一些表现出普遍性和代表性的毒理学指标,探讨了这些指标反应相关环境污染情况的潜力。最后,本研究采集了长江河口近岸水体的样本,开展了环境水样暴露实验,分析了使用斑马鱼胚胎暴露实验结合上述毒性指标检测的方法在表征环境水样污染时的有效性,并利用检测结果对长江河口区域近岸水体的污染现状和环境风险进行了评估。在形态学调查中,本研究发现TAM在最高浓度下(500μg/L)对96 hpf斑马鱼幼鱼产生了一定的致畸效应。暴露组的幼鱼体长变短,有轻度尾鳍缺损、表皮变暗、心率也出现了下降。后续的基因表达检测显示与表皮修复相关的krt17和egf基因的表达在TAM暴露组中有所上升,说明尾鳍缺损和表皮变暗是由于TAM对表皮组织的损伤造成的。在行为学调查中,本研究发现IBP和DCF的暴露会造成受试斑马鱼胚胎/幼鱼的行为发生变化。在28 hpf的胚胎早期自发运动检测中,IBP和DCF的存在会导致胚胎自发运动频率下降,降幅最高可达25%和28%。在48-60 hpf的胚胎孵化过程中,IBP和DCF暴露均能造成显著的孵化延迟,其在55 hpf时期的平均孵化率比对照组低63%和58%。在120 hpf的游泳行为检测中,IBP暴露会造成幼鱼黑暗条件下的自由游泳距离、时间和速度分别下降41%、29%和30%。DCF暴露则会造成幼鱼在光暗交替刺激下光照周期中的游泳距离和游泳时间均出现下降,降幅最高为17%和15%。在后续的基因检测中,与神经发育相关的neurod1和neurog1基因的表达在IBP和DCF作用下发生了变化。这些结果显示IBP和DCF能改变斑马鱼胚胎/幼鱼的行为,并具有潜在的神经毒性效应。在对内分泌相关的基因进行检测的过程中,本研究发现TAM和BPA的暴露对斑马鱼胚胎/幼鱼内分泌相关基因的表达有显著的影响。在TAM暴露实验组中,斑马鱼幼鱼体内的esr1、cyp19a1b、ar、hsd3b2和ugt1a1基因的表达量均显著升高,最高可达空白对照组的224%、2024%、153%、182%和154%,而vtg1基因的表达量则下调至空白对照组的71%。这些结果符合TAM选择性雌激素受体调节剂(SERM)的身份。在BPA暴露实验组中,斑马鱼幼鱼体内的esr1、cyp19a1b、ar、vtg1和ugt1a1基因的表达量也显著升高,最高可达空白对照组的188%、1554%、134%、141%和205%。这些结果符合BPA环境雌激素的身份。鉴于TAM暴露使具有重要的雌激素效应的cyp19a1b基因的表达提高了20倍,所以本研究认为,TAM在斑马鱼胚胎/幼鱼的早期发育过程中,主要表现为雌激素效应。在对代谢相关基因进行检测的过程中,本研究发现所有的5种PPCPs都会不同程度的诱导斑马鱼胚胎/幼鱼体内的代谢相关基因的表达,这反应了PPCPs污染对斑马鱼胚胎/幼鱼体内代谢和抗氧化应激体系的压力。在这些基因中,I相代谢相关的cyp3a65基因的表达受所有5种PPCPs的诱导(最高达336%),反映了其在斑马鱼代谢PPCPs过程中的重要性和普遍性。抗氧化应激体系相关的gpx1a和gsr基因的表达也受所有5种PPCPs的诱导(最高达184%和147%),表明了这两个基因对应的GSH体系在斑马鱼对抗氧化应激过程中的重要作用。此外,cyp1a、gstp1和cat基因也受到复数种PPCPs的诱导(最高达160%、140%和142%),表明其在代谢体系中也具有较为通用的作用。实验室暴露实验结果表明,形态学指标中的体长、心率和畸形,行为学指标中胚胎早期自发运动和孵化速度,以及esr1、cyp19a1b、ar、vtg1、cyp1a、cyp3a65、gpx1a、gstp1、gsr、gss、sod1和cat等基因的表达变化,都具有表征环境中PPCPs污染情况的潜力。在随后的环境水样暴露条件下,可以观察到上述指标不同程度的变化,这表明斑马鱼胚胎暴露实验结合这些指标检测的实验方法可以用于表征低浓度的环境污染。利用上述实验方法和毒理学指标,本研究对长江河口区域近岸水体的环境污染情况进行了检测。研究所用的水样采集自浏河口(LHK)、石洞口(SDK)和吴淞口(WSK)。在形态学检测中,SDK区域的水样造成了受试胚胎/幼鱼35.83%的死亡率,以及幸存幼鱼的发育不良。在行为学检测中,LHK和SDK区域的水样造成了胚胎早期自发运动频率增加(113%和121%)和孵化时间的显著提前(10h和14h)。内分泌相关基因的检测显示3个区域的水样都具有复杂的环境激素作用,LHK区域的水样诱导了cyp19a1b和ar基因的表达(133%和143%);SDK区域的水样诱导了esr1、cyp19a1b和vtg1基因的表达(183%、120%和143%),但抑制了ar基因的表达(80%);WSK区域的水样则诱导了esr1和ar基因的表达(135%和123%)。代谢相关基因表达的检测则表明LHK和SDK区域的水样对斑马鱼幼鱼的代谢和抗氧化机制存在干扰作用,LHK区域的水样诱导了cyp1a基因的表达(242%),但抑制了cyp3a65、gpx1a和sod1基因的表达(53%、77%和84%);SDK区域的水样则广泛的抑制了cyp3a65、gpx1a、gstp1、gsr、gss、sod1和cat基因的表达(10%、63%、77%、85%、83%、64%和44%)。这些结果表明,LHK、SDK和WSK区域的近岸表层水均存在明显的环境风险,长江河口区域近岸水体的污染情况不容乐观。
【图文】：

地图,长江河口区,地图

图 2-1 长江河口区域地图Fig. 2-1 Area map of the Yangtze River Estuary2.2 目标化合物本研究对目标物的筛选基于已有的文献资料和本学院其他相关的调查数据。先前的调查表明，长江口区域近岸水体中包含的 PPCPs 污染物种类繁多，但是多数物质的浓度较低，仅有一些常见 PPCPs 的含量可以达到数十至数百 ng/L 的水平（Yang et al., 2011b；Shi et al. 2014；Wu et al., 2014；Zhao et al., 2015）。这些物质对 PPCPs 造成的环境风险的整体贡献较大。因此在筛选暴露实验的目标化合物时，本研究综合考虑了上述调查数据、药物的作用机理和已有的研究报道，最终选定以下 5 种 PPCPs 作为斑马鱼胚胎/幼鱼急性毒性实验的目标化合物：他莫昔芬（TAM）、双酚 A（BPA）、布洛芬（IBP）、双氯芬酸（DCF）、对乙酰氨

离子色谱,目标化合物,标准溶液,数据组

图 2-2 目标化合物的离子色谱图（使用 50 μg/L 标准溶液进行检测）Fig. 2-2 Chromatograms of target compounds in 50 μg/L standard solution2.3.8 数据分析本研究所有实验数据均以平均值±标准误差（SEM）的形式记录。对于需要进行统计分析比较的数据组，首先需要进行正态分布检验和方差齐性检验。行为学测试的一系列结果符合方差齐性，故对这些数据组的分析比较使用了单因素方差分析法（one-wayANOVA），后续两两比较使用了 Tukey 检验。其余实验所得到的数据组多数不符合方差齐性条件，故不适合使用 one-wayANOVA 进行分析。但是这些数据组均符合正态分布，因此本研究使用了双尾异方差 T 检验来比较这些试验中处理组数据与对照组数据之间的差异。对于这两种分析检验，，本研究均选择概率 P < 0.05 为显著性差异标准。所有实验数据均由 Origin 8.5 软件处理分析。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X171.5

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