几类典型环境污染物细胞色素P450酶代谢及DNA损伤机制的理论研究

发布时间：2020-05-22 18:09

【摘要】：细胞色素P450酶(cytochrome P450)在生物体内源物质合成、外源化合物转化(代谢解毒/活化)过程中均起着极为重要的作用。特别地,一些有毒或致癌化合物本身不直接发挥毒性效应,而是经P450酶代谢后生成活性代谢产物,与蛋白质、DNA等生物大分子发生共价结合。由于P450酶的多功能性,以及其与后续反应中的DNA分子在生物体生理健康方面的意义,研究揭示相关机制非常重要。但常规实验手段存在一定不足,难以捕捉反应进程中寿命极短的过渡态与中间产物,耗费物力时间,受动物实验“3R原则”限制等。本论文采用理论计算手段,主要是密度泛函理论(density functional theory, DFT)方法,研究尚有争议的反应途径,尝试建立基于机理的有效预测模型,以期为辅助化学品环境与健康风险评价提供依据和参考。主要包括以下四部分内容：(1)为了解P450酶代谢卤代化合物的反应机理,我们以四氯甲烷(CCl4)和三氯甲烷(CHCl3)作为模型化合物,对其氧化途径、还原途径,以及产物形成机制进行了一系列的DFT计算。我们提出了在有氧条件下,P450酶氧化单体Compound I (Cpd I)与CCl4发生氯氧基化(氯提取)反应,并遵循典型的Groves型氢提取/自由基反弹机理；而在CHCl3的有氧代谢反应中,相较于氯提取过程,氢提取过程更易发生。进一步地,我们采用Marcus理论研究了CCl4和CHCl3还原途径,电子由P450酶五配位亚铁(Ⅱ)-卟啉复合物转移到卤代烷烃所需克服的能垒远低于Cpd I氧化途径中氯提取过程的能垒。此外,我们还对产物形成过程进行计算,据此推断最可能的生成机理,均很好地吻合了代谢实验观测到的现象。(2)很多物质在P450酶生物转化后能形成活性代谢产物,以烯烃类化合物为例,经代谢生成的环氧化产物,具有潜在的致癌效应。我们采用DFT计算,得到36个烯烃类化合物在P450酶Cpd I作用下的环氧化反应的活化能量,并确认反应能垒与化合物对应的电离势(ionizationpotential, IP)之间存在良好的线性相关。除加深对反应机理的本质了解外,这还提供了一种快速可行的预测模型；但对于大数据集需预先根据化合物极性强弱(偶极矩表征)进行分类,分别得到的数据模型(弱极性化合物：R2=0.972；强极性化合物：R2=0.936；训练集)经验证均具有很好的预测能力和稳健性。进一步地,通过对P450介导的环氧化与羟基化反应区域选择性现象的计算与实验结果的对比,显示我们所选用的计算与能量校正方法所得到的结果能够很好地重现实验趋势,证实了研究数据的合理有效性。(3)亲电性环氧化合物能与DNA亲核位点发生SN2反应,对DNA造成损伤引发后续毒性效应。对化合物的反应性进行定量可以预测评估其发挥亲电体介导毒性的潜在能力。我们采用DFT计算方法考察了37个不同结构类型环氧化合物与鸟嘌呤N7位点发生亲核加合反应的途径,并在大数据集下发现该反应的活化能垒与软硬酸碱理论(the theory of hard and soft acids and bases, HSAB)衍生的亲核指数(nucleophilic index)ω之间具有良好的线性相关性,这就意味着可以通过更为简捷的方式来替代大计算量的过渡态优化过程。通过亲核指数ω-建立的环氧化合物反应性预测模型(简单环氧化物：R2=0.970；多环环氧化物：R2=0.976；全数据集)具有很好的稳健性和预测能力,更重要的是,由于环氧化合物化学反应性与生物活性间良好的定量／定性关系,这一基于HSAB理论的模型亦在辅助预测环氧合化物毒性、评价致突变性／致癌性相关的SN2反应性方面有着一定的可行性。(4)我们选取有代表性的部分呋喃类化合物,对其在P450酶Cpd I作用下的氧化反应进行DFT计算,主要就中间产物的形成机制作初步探索。多数情况下,Cpd I作用于呋喃环邻位(2位、5位)生成的中间产物以二酮类化合物为主,作用于间位(3位、4位)生成的中间产物以环氧化合物为主。呋喃环上取代基的位置、大小极性都会对自身及相邻位点的反应性造成不同影响,且在多位取代时,四重态和二重态条件下可能形成不同的中间产物,值得进一步深入探索。
【图文】：

示意图,酶氧化,环氧化反应,单体

逦ＣＨ＝ＣＨ２逡逑＼邋ＣＨ３逡逑Ｃｙｓ逡逑图３．１细胞龟素Ｐ４５０酶氧化单体Ｃｐｄ邋Ｉ的结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ３．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｃｐｄ邋Ｉ邋ｏｆ邋Ｐ４５０ｓ逡逑４１逡逑

四重态,环氧化,二重态,优化结构

氯乙qI是典型的Ｐ４５０酶代谢底物，，有研究表明Ｐ４５０邋２Ｅ１可P暬趸纫襮I生成逡逑相应的强亲电活性的环氧化产物［１９２］，一种具有遗传毒性的致癌物我们ＬＸ氯乙qI逡逑为例，考察了邋Ｐ４５０~#Ｃｐｄｌ介导环氧化反应的具体途径（见表３．３），图３．３所示为逡逑Ｃｐｄｌ简并双态下氯己婿发生Ｃ＝Ｃ键环氧化的相对能量曲线图。从图中可ＬNB看到，该逡逑反应的起始亦是决定这个反应速率的步躁为Ｃ－０键的形成，通过过渡态４，２ｔＳｅ逡逑（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ邋ｓｔａｔｅ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｅｐｏｘｉｄａｔｉｏｎ）到自由基中间产物邋ＩＭ邋（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ邋），在所选逡逑用的基组水平下，该自由基中间产物的优化结构仅在四重态ＨＳ条件下得到。在后续逡逑环闭合生成环氧化产物Ｐ（ｐｒｏｄｕｃｔ）的步澡中，ＬＳ无能垒而ＨＳ有能垒（４ＴＳｒｃ，邋ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ逡逑ｓｔａｔｅ邋ｆｏｒ也ｅ邋ｒｉｎｇ邋ｃｌｏｓｕｒｅ邋），意味着ＬＳ的中间产物寿命很短进而自发地形成环氧化产逡逑物，而ＨＳ的中间产物有足够的寿命进行重排如生成酪类产物，这同一垫代谢实验结逡逑论相吻合。这一区别的本质在于ＬＳ与ＨＳ路径不同的电子转移过程Ｐ１
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X503.2

【参考文献】