池蝶蚌金属硫蛋白对重金属诱导响应及其转录调控机制
发布时间：2020-05-25 20:42
【摘要】：金属硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是一类分子质量为6-7 kDa,富含半胱氨酸(约含30%)的可诱导的多功能蛋白。金属硫蛋白广泛存在微生物,植物及动物等生物体中,扮演着清除非必需重金属、调节必需重金属浓度及抗氧化等重要功能。池蝶蚌是1997年从日本琵琶湖(Biwa Lake)引进的一种具有重要商业价值的淡水珍珠育珠蚌。由于池蝶蚌营底栖滤食性生活,加之其行动缓慢,导致其不可避免并直接地暴露在含重金属的水环境中。但是,到目前为止,有关淡水珍珠蚌金属硫蛋白作为环境重金属分子标记物的探究,以及金属硫蛋白基因的表达调控机制的相关研究报道均较为罕见。本研究的主要内容、结果和结论如下:1、分析和比较了正常情况下1龄、2龄及3龄池蝶蚌5种组织(鳃、外套膜、足、内脏团和消化腺)中锌(Zn)、镉(Cd)、铅(Pb)及铜(Cu)4种重金属含量。鳃是各种重金属蓄积最高的组织,蓄积量约为35-60%。在1-3龄蚌中,各组织中Cd含量高低次序为:鳃消化腺外套膜内脏团足;各组织中Zn含量高低次序为:鳃外套膜≥足消化腺≥内脏团;而在各组织中,Cu和Pb的含量没有出现组织特异性:如1龄蚌的鳃组织中Cu的含量占比为60.06%,而3龄蚌的内脏团或者消化腺的Cu含量占比最高,约为35.12%,而鳃组织中仅为20.17%;各龄蚌中,在鳃组织中Pb含量占比最高,而其他4种组织并未出现一定的次序性。结果证明,池蝶蚌能积累一定浓度的重金属,而鳃是重金属积累的主要组织。进一步,采用Cd胁迫实验(Cd浓度为0、0.005、0.05和0.5 mg/L,时间为1、3、5和7天),研究Cd胁迫下,1龄池蝶蚌体内Cd的蓄积量及对应MT的水平。实验结果发现,在浓度为0.05和0.5 mg/L的Cd胁迫下,池蝶蚌体内Cd的蓄积量和MT的水平都显著提高(p0.01),但是并未发现两者有时间积累效应。相关性分析显示,5种组织大部分时间点中Cd的累积量与MT的水平呈正相关。说明池蝶蚌体内的MT可作为监测环境中Cd的分子标记物。2、通过分子生物学方法,首次克隆了2个池蝶蚌金属硫蛋白基因的cDNA序列(HsMT1和HsMT2)。结果显示,HsMT1全长589 bp,开放阅读框216 b p,编码71个氨基酸,蛋白分子质量为7.14 kDa,等电点为7.24。HsMT1蛋白包含21个半胱氨酸(Cys),占总氨基酸的29.6%,缺乏组氨酸和芳香族氨基酸。蛋白结构中包含9个Cys-X-Cys,1个Cys-X-X-Cys,6个Cys-X-X-X-Cys以及1个Cys-Cys结构域(X代表了除Cys以外的其他氨基酸),在其C端保留有保守的金属硫蛋白结构域Cys-x-Cys-x(3)-Cys-Thr-Gly-Cys-x(3)-Cys-x-Cys-x(3)-C ys-x-Cys-Arg。而HsMT2全长667 bp,开放阅读框222 bp,编码73个氨基酸,蛋白分子质量为7.99 kDa,等电点为4.58。HsMT2蛋白半胱氨酸含量占总氨基酸的27.4%,含有组氨酸但缺乏芳香族氨基酸。蛋白结构中包含8个Cys-X-Cys和7个Cys-X-X-X-Cys,在其C端结构域为Cys-x-Cys-x(3)-Cys-Lys-Gly-x(3)-Cys-x-Cys-x(3)-Cys-x-Cys-His。两者Genbank的登陆号分别为KJ019820和KJ019821。HsMT1和HsMT2的同源性分析发现,两者虽然仅具有46.5%的相似性,但是在Cys区域显示高度的保守性。系统进化树显示,HsMT1同其他贝类的聚为一起,而HsMT2却脱离淡水和海水贝类MT并与斑马鱼聚为一支。荧光定量结果显示,HsMT1在所有组织中均有表达,并在肝胰腺中表达量最高,而HsMT2却特异性地在性腺中高度表达。在5ppm浓度的重金属Cd胁迫下,HsMT1和HsMT2的mRNA水平均出相似的表达模式,且呈现出“下降-恢复-下降”的趋势。进一步比较了转HsMT1和HsMT2基因重组大肠杆菌的Cd耐受性,结果发现含有HsMT1基因的大肠杆菌具有更高的Cd耐受性。这些结果揭示,池蝶蚌HsMT1和HsMT2基因是金属硫蛋白家族成员,且均涉及金属应答反应,但是HsMT2可能还具有其他的生理功能。3、研究了池蝶蚌金属硫蛋白基因转录调控机制,采用Genome walking和Genome walker方法,克隆获得了长度为1121和1270 bp的HsMT1和HsMT2的启动子序列(Genbank登陆号分别为KX279831和KX279832)。分析发现,两个启动子序列都含有丰富的腺嘌呤和胸腺嘧啶(A+T),其中HsMT1中A+T占比61.5%,而HsMT2中占比60.5%;其次,两者都包含典型的TATA序列(TATAAA)。但是,两个启动子的金属应答元件(Metal Response Elements,MREs)的数量和位置不同。HsMT1启动子区域含有一个MRE元件(TGCGCAC),位于起始密码子上游的-588至-594 bp处,而HsMT2启动子区域含有近端和远端两个MRE元件(TGCACAC和TGCGCAC),分别起始密码子上游的-135至-141bp处和-540至-546处。进一步构建了启动子-荧光素酶报告基因载体分析两启动子功能。结果发现,在HepG2细胞中,HsMT1和HsMT2的启动子都可以被不同浓度的Zn~(2+)、Cu~(2+)和Cd~(2+)离子激活,并且表现出不同程度的金属离子诱导性。截短启动子活性分析实验显示,最长的启动子具有最大的金属诱导活性,并且这种活性依赖于HsMT1中的MRE或HsMT2中的远端MRE元件,一旦该元件缺失,启动子会丧失金属诱导活性。4、进一步克隆了1个金属应答转录因子类似物HsMTF-like(Metal responsive transcription factor like,MTF-like)。HsMTF-like cDNA全长2033 bp,含有开放阅读框1551 bp,编码516个氨基酸,预测蛋白分子质量大小为57.32kDa。HsMTF-like蛋白中有6个保守的锌指结构域,与其他物种具有较高的保守性,如人(39.44%)、鼠(39.44%)、河豚(38.89%)和斑马鱼(38.89%)。其Genbank登陆号为KY211621。通过构建真核表达载体(pcDNA-HsMTF-like)和含MRE突变的启动子-荧光素酶报告基因载体,共转染进入HepG2细胞,探究在HepG2细胞中HsMTF-like对HsMT1和HsMT2基因表达影响。结果发现,HsMTF-like能通过与MRE相互作用,增强HsMT1和HsMT2的基础转录水平。并且金属离子Zn~(2+)的刺激会进一步增强该转录水平。同时发现,HsMT2启动子中的两个MRE元件在HsMT2基因激活过程中活性和所起贡献有所不同。结合脊椎动物和牡蛎MT转录机制的研究,认为池蝶蚌MT的转录调控机制应该与脊椎动物相似且在进化过程中具有保守性。
【图文】：
图 1.2 重金属清除曲线Fig.1.2 Curvilinear depuration of heavy metals.贝类体内，重金属的积累程度主要是依靠生物的或者非生物的变经被证明是有效的生物监测物种（Biomonitors），，主要基于以下几能在不致死浓度的重金属环境中积累重金属，能持续不断地暴露在以及方便取样。在水体中，很多微量的元素都会对环境中生物有毒金属浓度会导致金属不耐受的物种减少甚至灭绝，因此对生物多样影响。周围环境或者食物中的积累的污染物会导致受影响生物的潜或者毒害食物链中更高等的生物，最终结果会毒害人类的健康。生量污染物对水体中生物影响。在研究过程中，用来生物监测的物种有种或者引入种。依据考察污染物对生物的急性或慢性影响，确定间是短期还是长期。受重金属胁迫的贝类可能在发生生物化学的可能是重金属胁迫后潜在的生物标记物或者是重金属在贝类体内
图 1.3 金属硫蛋白与金属离子结合模型。A 表示 apoMT 或 ZnMT 鳌合 Cd，阻断 Cd 的毒性B 表示 MT 从其它 Cd 结合蛋白中抓取 Cd，使蛋白恢复结构和功能；C 表示 MT 作为 Zn 供体，通过 Zn/Cd 交换，将 Zn 供与 Cd 损害 ZnMT，使其结构恢复[14]。Fig.1.3 Model of interactions of metallothionein (MT) with toxic metals and target of mettoxicity. (A) Metal-free apoMT or ZnMT binds cadmium, thereby interrupting the cadmium toxi(B)MT abstracts cadmium from a cadmium-impaired target protein and then restores structure anfunction to the target; (C)MT serves as a zinc donor to Cd-impaired ZnMT by the exchange Zn/Cd exchange, then restoring its structure and function[14].1.4 金属硫蛋白的正负调控机制金属硫蛋白的活性受多种转录因子调控，包括 TATA 结合蛋白（TATA-bindinprotein，TBP）、TBP 相关因子以及 Sp1。另外，MT 也能被多种刺激物激活，包括金属离子、细胞因子和生长因子[15]。一些转录因子已经被鉴定，如金属应答转录因子 1（Metal Responsive Transcription Factor-1，MTF-1），上游刺激因子（Upstream Stimulatory Factor, USF）以及核因子 1（Nuclear Factor，NF1）[16]。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4;X171.5
本文编号：2680719
【图文】：
图 1.2 重金属清除曲线Fig.1.2 Curvilinear depuration of heavy metals.贝类体内，重金属的积累程度主要是依靠生物的或者非生物的变经被证明是有效的生物监测物种（Biomonitors），，主要基于以下几能在不致死浓度的重金属环境中积累重金属，能持续不断地暴露在以及方便取样。在水体中，很多微量的元素都会对环境中生物有毒金属浓度会导致金属不耐受的物种减少甚至灭绝，因此对生物多样影响。周围环境或者食物中的积累的污染物会导致受影响生物的潜或者毒害食物链中更高等的生物，最终结果会毒害人类的健康。生量污染物对水体中生物影响。在研究过程中，用来生物监测的物种有种或者引入种。依据考察污染物对生物的急性或慢性影响，确定间是短期还是长期。受重金属胁迫的贝类可能在发生生物化学的可能是重金属胁迫后潜在的生物标记物或者是重金属在贝类体内
图 1.3 金属硫蛋白与金属离子结合模型。A 表示 apoMT 或 ZnMT 鳌合 Cd，阻断 Cd 的毒性B 表示 MT 从其它 Cd 结合蛋白中抓取 Cd，使蛋白恢复结构和功能；C 表示 MT 作为 Zn 供体，通过 Zn/Cd 交换，将 Zn 供与 Cd 损害 ZnMT，使其结构恢复[14]。Fig.1.3 Model of interactions of metallothionein (MT) with toxic metals and target of mettoxicity. (A) Metal-free apoMT or ZnMT binds cadmium, thereby interrupting the cadmium toxi(B)MT abstracts cadmium from a cadmium-impaired target protein and then restores structure anfunction to the target; (C)MT serves as a zinc donor to Cd-impaired ZnMT by the exchange Zn/Cd exchange, then restoring its structure and function[14].1.4 金属硫蛋白的正负调控机制金属硫蛋白的活性受多种转录因子调控，包括 TATA 结合蛋白（TATA-bindinprotein，TBP）、TBP 相关因子以及 Sp1。另外，MT 也能被多种刺激物激活，包括金属离子、细胞因子和生长因子[15]。一些转录因子已经被鉴定，如金属应答转录因子 1（Metal Responsive Transcription Factor-1，MTF-1），上游刺激因子（Upstream Stimulatory Factor, USF）以及核因子 1（Nuclear Factor，NF1）[16]。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4;X171.5
【参考文献】
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本文编号：2680719
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