柔性金属对大肠杆菌毒性机理的研究

发布时间：2020-05-29 01:54

【摘要】：方面,随着现代工业的不断发展,金属污染逐渐成为威胁地球生命安全的重要因素。另一方面,一些金属作为抗菌器材在许多领域得到广泛的应用,为人类生活尤其是医疗卫生事业带来极大便利。这两者都是金属对细胞毒性的客观反应。这使得金属的细胞毒性机理日益成为国内外研究的热点。众多研究将金属的毒性归因于氧化应激,即通过产生活性氧化物质破坏细胞的DNA、蛋白等组分而使细胞致毒。然而最新研究表明铜对大肠杆菌致毒时首先破坏细胞中心代谢通道中一类关键性的铁-硫簇脱水酶,且该作用源于铜的强亲硫性。银、汞、镉、锌、铅、镍、钴和锰与铜类似同样具备强亲硫性,都属于柔性金属的范畴,因此推测这些金属的毒性机理存在相似性。本研究系统研究了各柔性金属对大肠杆菌的抑制作用、对细胞体外含外露[4Fe-4S]簇的延胡索酸酶A (fumA)的作用以及生长抑制临界浓度下对细胞体内各类酶的作用,对柔性金属的毒性机理进行了全面深入的分析,表明了该类酶为柔性金属银、汞、镉和锌致毒的第一靶点,确认了金属的“亲硫性”为其致毒的关键性因素。研究主要内容包括： 1.金属对细胞毒性机理的探索研究已经证明铁使细胞致毒的原因是因为它能催化Fenton反应产生羟基自由基(·OH)而破坏细胞。铜、三价铬与铁同样具备该能力,且抗坏血酸能够作为一种促氧化剂而促进金属的还原及Fenton反应的循环发生。为了探索铜对细胞的致死率与氧化应激的关系,且验证铜毒性与羟基自由基导致的细胞结构破坏的猜想,研究了Cu(Ⅱ)与抗坏血酸(L-AscA)体系对E. coli的致死率,并与同能参与Fenton反应的Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅲ)的作用进行了比较分析,进而用电子自旋共振技术(ESR)分析了各体系产生的OH的量与致死率的关系。结果表明：LAscA的加入极大增强了Cu(Ⅱ)对E. coli的致死率,且两者共存体系下,E. coli死亡率呈Cu(Ⅱ)浓度依赖。相应的,0.01%L-AscA的加入加倍了0.2mM Cu(Ⅱ)体系中的·OH浓度,与致死率分析中L-AscA的加入极大增强了Cu(Ⅱ)的毒性一致；此外,L-AscA/Cu(Ⅱ)共存体系中,Cu(Ⅱ)浓度高于0.1mM时,产生的·OH浓度与Cu(Ⅱ)浓度成正比,同样与致死率分析中Cu(Ⅱ)浓度依赖结果相吻合。而200μM的Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅲ)未能检测到羟基自由基的产生,它们对细胞的毒性也相对弱于Cu(Ⅱ)。分析结果综合表明在致死剂量下Cu(Ⅱ)的确能诱发·OH的产生,且产生量与铜对大肠杆菌的致死率成正相关。但有趣的是,当Cu(Ⅱ)浓度为0.02mM时,与0.01%L-AscA共存体系下,ESR无法检测到·OH,然而该体系对E. coli的毒性反而大于检测到较高·OH浓度的0.2mM Cu(Ⅱ)单独系统。这意味着,在较低Cu(Ⅱ)浓度下,存在氧化应激之外的其它毒性机制。与此同时,最新研究表明,由于Cu(Ⅱ)尤其是Cu(Ⅰ)的强亲硫性,在非致死剂量下便能破坏E. coli中外露的铁-硫簇脱水酶而成为其致毒的首要原因,该研究成果确切解释了本研究中出现的这一矛盾现象。 2.柔性金属对E. coli的抑制作用分析铜为柔性金属中的一种,为了验证这种由于强亲硫性而致毒的机理是否具有共通性,首先分析了银、汞、镉、锌、铅、镍、钴、锰在标准基本培养基中对E. coli的抑制作用。并以银为代表,深入分析了其抑制作用的影响因素。结果表明,在简单基本培养基中,极低浓度的Ag(Ⅰ)和Hg(Ⅱ)(0.15μM)便能抑制E. coli生长,这与这两种金属公认的极强抗菌性相一致。较高浓度的Ni(II)、Co(Ⅱ)(分别为400μM和200μM)才开始抑制细胞的生长；其它柔性金属未表现出明显抑制作用；此外,银对E. coli的抑制作用与好氧或厌氧状态无关,而与培养基种类、培养基组分和菌液浓度高度相关,表明了其毒性与氧化应激无关。 3.柔性金属对活体细胞外fumA的作用延胡索酸酶A (fumA)是一种典型的铁-硫簇脱水酶,因为其铁-硫簇外露很容易成为一些有毒物质的攻击对象。为了验证柔性金属是否能破坏[4Fe-4S]簇而使fumA失活,首先在厌氧条件下提纯了延胡索酸酶A,并逐一测定了上述八种柔性金属对纯化fumA活性的作用。通过底物保护,失活fumA的活性还原、ESR对失活后fumA的Fe-S簇结构解析以及酶失活过程中同步铁原子释放等研究手段对柔性金属的作用机制进行了系统分析。微摩尔浓度的Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)和相对较高浓度的Cd(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)能以极快的速度使纯化fumA失去活性,使fumA失活的能力与其亲硫性强弱相吻合,但高达毫摩尔浓度的Pb(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)未对fumA (?)舌性产生影响。ESR和铁离子释放分析证实了各金属作用于酶的活性位点[4Fe-4S]簇,而且失活后的酶能够通过Fe-S簇重建而重新获得活性。Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)作用后fumA的[4Fe-4S]簇被完全降解,而Zn(Ⅱ)作用下失活后则部分呈[3Fe-4S]形式。 4.柔性金属对活体细胞内各类酶的作用。一个关键问题是铁-硫簇酶是否为柔性金属Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)使细胞致毒过程中的首要攻击目标。为此必须通过细胞活体内的研究进行确认。因此,首先测定了各金属对E. coli的生长-抑制剂量；继而在对应边界剂量下,分析了各金属对细胞中含外露[4Fe-4S]簇的脱水酶活性的影响,同时研究了各金属对Fe-S簇组装(Isc)系统的影响。结果表明致毒边界剂量下的Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)便能破坏外露的[4Fe-4S]簇酶fumA、异丙基苹果酸异构酶和6-磷酸葡萄糖脱水酶,而且失活后的酶活性同样可以被还原。而且这四种金属不能使几种其它类型的酶失活,这些酶包括不含Fe-S簇的p-半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶以及含有内嵌式铁-硫簇的Ndh Ⅰ脱氢酶；此外四种金属都能破坏E coli中的铁-硫簇组装系统。结果综合表明了活体细胞内各金属在开始抑制细胞生长的剂量下便能破坏这一类含外露[4Fe-4S]簇的脱水酶,且其作用具有专一性。总之,本研究结果表明了柔性金属的毒性机理存在共通性。柔性金属Cu(Ⅰ)、Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)在对E.coli致毒时,首先破坏细胞中含外露[4Fe-4S]簇的一类脱水酶。且该作用是由于各金属共同的强亲硫性,通过破坏酶的活性位点[4Fe-4S]簇而使酶失活,其致毒能力与各金属亲硫性强弱相一致。
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X172

【引证文献】