中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3龙胆酸1，2-双加氧酶的表达、纯化及功能研究

发布时间：2017-03-26 17:05

  本文关键词：中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3龙胆酸1，2-双加氧酶的表达、纯化及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是油田污染土壤中广泛存在的“三致”化合物,油田PAHs的污染土壤通常具有高盐,高pH和PAHs浓度高等特点,将非嗜盐的PAHs高效降解菌引入到盐碱环境中去除PAHs的效果往往不理想。针对盐碱土壤PAHs污染生物修复效率较低的现状,采用中度嗜盐PAHs高效降解菌的生物降解方法日益受到关注,阐明中度嗜盐菌降解PAHs的机理及关键降解酶的催化机制是应用该菌实现生物强化修复的前提。本研究以盐碱条件下能够降解多种PAHs的中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3为研究对象,在基因组测序基础上,利用特异性引物克隆了龙胆酸1,2-双加氧酶(Gentisatel,2-dioxygenase, GDO)基因,并实现其在大肠杆菌E.coli21(DE3)中成功诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白GDO,并对其进行了酶学性质的分析；同时通过在高盐度下以PAHs为唯一碳源和低盐度下以甘油为唯一碳源的不同条件下培养AD-3菌,结合Label-Free技术分析不同培养条件下菌株中蛋白的差异表达；最后基于CRISPR-Cas9构建菌株AD-3基因敲除体系,并利用该体系敲除GDO基因。主要结论如下：(1)以AD-3菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得1,077 bp的GDO基因,该基因在E.coli21(DE3)中成功表达,纯化的GDO经变性凝胶电泳和非变性凝胶电泳结果显示大小分别约为38 kDa和120 kDa,该结果表明GDO为同源三聚体；GDO在pH 7.0,30℃,盐度12%条件下具有最佳活性,该酶对龙胆酸的Km和kcat值分别是26.64μM和161.29 s-1；基于同位素标记方法,首次发现GDO催化龙胆酸的两个氧原子分别来自于H20和02的加氧机制；利用基因定点突变将GDO中高度保守的四个组氨酸分别突变为不携带电荷的赖氨酸,突变体蛋白全部失活,充分证明了四个组氨酸的重要性。(2)基于差异蛋白质组学分析不同培养条件下AD-3菌的蛋白表达差异,共识别出上调的蛋白187个,与PAHs降解相关蛋白16个,与嗜盐相关的蛋白8个。结合AD-3菌全基因组序列和差异蛋白数据,上调蛋白中与PAHs降解相关的关键酶-PAHs起始双加氧酶的a和p亚基,表达量分别上调149.7倍和41倍；嗜盐相关上调蛋白主要包括相容性溶质甘氨酸甜菜碱合成关键蛋白上调19.1倍,以及甘氨酸甜菜碱转运相关关键蛋白Transpotor ABC上调6.6倍。(3)基于CRISPR-Cas9构建GDO基因的敲除质粒pTC-gdo-3580,将该质粒电转至AD-3菌中,用氨苄抗性筛选获得转化子,经过IPTG诱导获得突变菌株AD-3-pCT-gdo-3590。与野生型AD-3菌能够利用龙胆酸为唯一碳源且观察到明显颜色变化相比,突变株未观察到明显生长和颜色变化,初步证明GDO基因敲除成功,该敲除体系为探索AD-3菌中为更多未知基因功能提供有力的工具。
【关键词】：中度嗜盐菌 微生物降解 GDO 差异蛋白质组学 CRISPR/Cas体系
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第1章 绪论11-22
• 1.1 研究背景11
• 1.2 多环芳烃的微生物降解11-15
• 1.2.1 多环芳烃的微生物代谢途径11-13
• 1.2.2 GDO研究进展13-15
• 1.3 蛋白质组学及其应用15-17
• 1.3.1 蛋白质组学概念15-17
• 1.3.2 差异蛋白质组学概述17
• 1.4 Crispr/cas9基因敲除体系概述17-20
• 1.4.1 Crispr/cas9基因敲除体系的发现历程18
• 1.4.2 Ⅱ型CRISPR/Cas功能行使机制18-20
• 1.5 研究目的及内容20-22
• 1.5.1 研究目的20
• 1.5.2 研究内容20-21
• 1.5.3 课题意义21
• 1.5.4 技术路线21-22
• 第2章 龙胆酸1,2-双加氧酶的功能及性质研究22-38
• 2.1 引言22
• 2.2 实验材料与方法22-27
• 2.2.1 实验材料22-23
• 2.2.2 实验方法23-27
• 2.3 结果与讨论27-37
• 2.3.1 GDO基因的序列分析27-28
• 2.3.2 GDO表达质粒的构建28
• 2.3.3 GDO表达的优化28-29
• 2.3.4 GDO蛋白的纯化29-30
• 2.3.5 GDO酶学性质研究30-33
• 2.3.6 GDO催化龙胆酸的机制研究33-34
• 2.3.7 龙胆酸氧化过程中的快速动力学研究34-35
• 2.3.8 基因定点突变实验35-36
• 2.3.9 龙胆酸降解过程中gdo转录水平研究36-37
• 2.4 本章小结37-38
• 第3章 中度嗜盐菌AD-3差异蛋白质组学研究38-58
• 3.1 引言38
• 3.2 材料与方法38-41
• 3.2.1 实验材料38
• 3.2.2 实验方法38-41
• 3.3 结果与讨论41-57
• 3.3.1 SDS电泳检测蛋白表达量及主要上调蛋白鉴定41-43
• 3.3.2 差异蛋白质组学分析43-57
• 3.4 本章小结57-58
• 第4章 中度嗜盐菌AD-3基因敲除体系构建58-68
• 4.1 引言58
• 4.2 材料与方法58-61
• 4.2.1 实验材料58-59
• 4.2.2 实验方法59-61
• 4.3 结果与讨论61-67
• 4.3.1 构建敲除质粒pTC61-65
• 4.3.2 敲除gdo65-67
• 4.4 本章小结67-68
• 第5章 结论与展望68-69
• 5.1 结论68
• 5.2 展望68-69
• 参考文献69-80
• 致谢80-81
• 已发表论文81-82
• 附录1：主要实验仪器82-83
• 附录2：主要实验试剂83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 周金伟;徐绮嫔;姚婧;余树民;曹随忠;;CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J];遗传;2015年10期

2 殷利眷;胡斯奇;郭斐;;CRISPR-Cas9基因编辑技术在病毒感染疾病治疗中的应用[J];遗传;2015年05期

3 陈勇龙;黄华荣;唐平平;羊雪芹;李斐雪;许杰;张遵义;;基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统[J];杭州师范大学学报(自然科学版);2015年01期

4 郑小梅;张晓立;于建东;郑平;孙际宾;;CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展[J];生物技术进展;2015年01期

5 王梦瑶;杨亦农;边红武;;基于CRISPR-Cas系统的基因组定点修饰新技术[J];中国生物化学与分子生物学报;2014年05期

6 颜雯;李海涛;向华;王晓虎;;CRISPR-Cas基因组改造技术研究进展[J];广东农业科学;2014年02期

7 刘思也;夏海滨;;一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J];中国生物工程杂志;2013年10期

8 李君;张毅;陈坤玲;单奇伟;王延鹏;梁振;高彩霞;;CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J];遗传;2013年11期

9 李浩;邱少富;宋宏彬;;成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)基因组编辑技术研究进展[J];微生物学报;2013年10期

10 方锐;畅飞;孙照霖;李宁;孟庆勇;;CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J];生物化学与生物物理进展;2013年08期

  本文关键词：中度嗜盐菌Martelella sp.AD-3龙胆酸1，2-双加氧酶的表达、纯化及功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：269086