群体感应在污染物生物降解过程中的作用的研究

发布时间：2020-06-03 20:19

【摘要】： 群体感应是一种普遍存在的微生物细胞与细胞之间的信息交流机制。群体感应使单细胞微生物之间能够在“群体水平”上“相互协作”,完成一些单细胞无法进行的生物过程。以酰基化高丝氨酸内酯(Acylated Homoserine Lactone, AHL)作为信号分子的群体感应系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中,并在许多生物过程中都扮演了重要角色。微生物是污染物生物降解的主力军,但是群体感应在污染物生物降解过程中的作用缺乏研究。仅一篇文献报道AHL信号分子的添加能够改变活性污泥的微生物菌群组成,并提高活性污泥污染物处理能力的稳定性。但AHL信号分子是否能在污染物降解过程中合成,群体感应对微生物的生物降解能力的调控及机制尚未见报道。本学位论文以芳香族化合物作为典型的难清除有毒污染物,以AHL介导的群体感应作为典型研究对象来探讨群体感应在污染物降解过程中的作用。这将为我们从微生物群体视角来认识污染物生物降解的调控过程提供有用信息,同时也对从群体角度开发新的高效生物降解策略有着重要意义。本论文首先拟以AHL群体感应系统和芳香族污染物生物降解过程作为典型对象建立一个简单的研究模型。通过筛选得到了一株具有AHL群体感应系统且有较强芳香族污染物降解能力的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CGMCC 1.860,并对其降解特性进行了分析。PCR及生物信息学分析表明,该菌苯酚羟化酶基因簇由一个转录因子(phcR)和六个亚基(phcPONMLK)组成,而儿茶酚间位途径基因在一个由转录因子(nahR)和十个结构基因组成的NAH基因簇上,关键酶儿茶酚2,3-双加氧酶(C230)由nahH编码。另一方面,分析确认了该菌具有完整的Rhl群体感应系统(rhlIR基因簇),并在LB培养基中具有短链AHL合成能力。进一步通过同框缺失(In-frame deletion)技术,构建了Rhl群体感应系统的缺失菌株△rhlI,△rhlIR。该简单模型以P. aeruginosa CGMCC1.860为供试菌株,芳香族污染物为底物,可用于研究Rhl群体感应系统对芳香族污染物生物降解的调控作用。 AHL信号分子定量检测方法非常缺乏,尤其是对有毒环境样品中AHL信号分子的定量检测方法至今未见报道。本研究通过筛选得到了一株能够在BHL(N-butyryl-homoserine lactone,一种AHL,Rhl群体感应系统的信号分子)添加条件下产生绿色色素(pyocyanin)的铜绿假单胞菌,通过基因工程手段将该菌株构建成了一个以色素产生为信号输出的BHL定量检测生物传感器,利用该传感器可以简单地通过分光光度法对BHL进行定量检测。其最低检测限较以往的方法有大幅降低。同时对该生物传感器的抗干扰能力、稳定性、可靠性进行了验证,并且在污水样品中得到了成功的应用。该方法为进一步深入研究群体感应信号分子在污染物降解过程中的积累规律及群体感应对污染物降解过程的调控机制提供了简单经济的定量检测工具。虽然已报道从活性污泥等污染物处理过程中分离到了能够在复合培养基中产生AHL信号分子的菌株,但是至今未有报道表明AHL信号分子能否在污染物生物降解过程中合成。同时关于群体感应对微生物污染物降解能力的影响作用至今未见报道。通过生物传感器检测、薄层层析(TLC)和HPLC-APCI-MS/MS分析表明P. aeruginosa CGMCC1.860在芳香族污染物降解过程中能够合成BHL(N-butyryl homoserine lactone)和HHL(N-hexanoyl-homoserine lactone),且BHL为主要成分。接着,我们发现P. aeruginosa CGMCC 1.860的AHL粗提物能够提高该菌的苯酚降解能力,但不含有短链AHL的粗提物对该菌的苯酚降解能力无明显影响。该结果表明外源添加的短链AHL(主要是BHL,由rhlI合成)能够提高铜绿假单胞菌的苯酚降解能力。由此推测Rhl群体感应系统在该过程中对生物降解具有调控作用。通过比较野生型菌株、△rhlI、△rhlIR及其回补菌株的降解能力,结果表明Rhl群体感应系统能够提高铜绿假单胞菌的芳香族污染物降解能力。我们进一步探索了Rhl群体感应系统对芳香族污染物降解关键酶酶活及基因转录水平的影响。以苯酚降解作为典型有毒芳香族污染物生物降解过程,通过对三种条件下(野生型,△rhlI,△rhlI+BHL)菌株降解过程的比较分析表明,Rhl群体感应系统能够在转录水平上正向调控转录因子nahR表达,以nahH为代表的NAH基因簇也受到Rhl群体感应系统的正向调控,同时C230酶活也受到群体感应的正向调节。由此推测,Rhl群体感应系统对儿茶酚间位途径的促进是其提高芳香族污染物降解能力的主要原因。另一方面,在对数生长后期,Rhl群体感应系统对苯酚羟化酶系统phcR和phcP,全局性调控因子relA, spoT, crc的表达都表现出负调控。这些结果显示了群体感应在污染物降解过程对细胞调控的复杂性,同时也为进一步深入研究提供了基础。本研究建立了一种用于环境样品中AHL信号分子定量检测的生物传感器,证明了AHL信号分子能够在污染物降解过程中合成,并发现Rhl群体感应系统能够提高铜绿假单胞菌芳香族污染物降解能力,进一步获得了群体感应系统对芳香族污染物调控的分子信息。这些信息和工具为今后进一步深入研究群体感应对芳香族污染物生物降解的调控机制,从群体视角有目的地调节芳香族污染物的生物降解,奠定了良好的基础,并对于研究其他群体感应系统在其他污染物降解过程中的作用也具有良好的借鉴作用。
【图文】：

群体感应,革兰氏阴性细菌,生物学过程,生物学

图IJAHL介导的群体感应的生物学作用概述1131Fig.1.3Biol鲍iealrolesofAHLmediatedquorumsensi吧性131研究表明，AHL介导的群体感应在革兰氏阴性细菌中调控了大量的生物学过

模型图,群体感应,铜绿假单胞菌,模型

其中研究比较清楚的是 Pseudomonasaeruginosa的群体感应系统。 paer林ginosa有两种相对独立的AHL介导的群体感应系统，，即Las群体感应系统和 Rhl群体感应系统(图1.4)l’，’SJ。p。eruginosa的Las群体感应系统由转录调节蛋白LasR和3一oxo一c12HsL(N-(3一oxo卜dodecanoyl一 homoserinelactone，odDHL)合成酶Lasl组成;Rhl群体感应系统由C4HSL(N-but”叹 1homose血 elactone，B批)合成酶Rhll和转录调节蛋白Rh1R组成(图1.4)【’51。当信号分子BHL或odDHL的浓度达到一定闭值，它们就与相应的转录调节蛋白Rh1R或LasR的N端结合形成复合体并改变调节蛋白的构象，使转录调节蛋白C末端能够与目标基因特定的DNA区域结合，从而调控目标基因的表达(图1.4)[’泌]。群体感应Las系统主要控制着一些毒性因子的产生，如弹性蛋白酶和溶血素等【2743]。而R五l系统调控着诸如pyocy田吐n合成、铁载体及鼠李糖合成等过程[l5]。转录组学和蛋白组学的研究表明
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X172

【引证文献】