路易斯安那鸢尾铅耐性机理及相关基因挖掘研究

发布时间：2020-06-05 01:34

【摘要】：路易斯安那鸢尾(Louisianairis)属鸢尾科鸢尾属(IrisL.),因其具有喜水湿、抗性强、常绿、生物量相对大而广泛用于园林的水体绿化和景观配植。目前我国耕地和河流湖泊重金属污染严重,治理刻不容缓。植物修复技术绿色环保,是铅等重金属萃取修复相对彻底的污染修复治理技术。自然中铅超富集植物多由于生物量小等难以推广,本文以路易斯安那鸢尾为材料,从植物对铅富集能力、理化以及转录组、基因功能等多层面进行研究,为进一步进行植物抗(耐)性发生机理机制以及培育高效选择性吸收和积累重金属离子应用型超积累植物新种质研究提供依据。主要内容与结论如下:1.路易斯安那鸢尾9个品种中'Professor Neil'对Pb吸收和富集量最大。随着Pb溶液浓度的升高,植株的株高、新发不定芽数、存活叶片数、根长、根数、鲜重及干重均呈下降趋势,而叶片、根状茎和根系Pb含量也随Pb浓度的增加而增加,顺序为根系根状茎叶片。叶片在800 mg/L Pb时达到4,011 mg/kg DW。随着Pb浓度的升高,根系耐受指数(IT)逐渐下降,在大于600mg/L Pb后存在显著性差异。根至茎Pb转移率(R/R)和茎至叶Pb转移率(R/L)都呈先上升再下降的趋势,R/R在800mg/L Pb处理时达到最大值10.02%,R/L在600mg/L Pb处理时达到最大值57.78%。电镜超微结构观察到Pb主要富集在根的细胞壁和胞间隙中。2.Pb胁迫下路易斯安那鸢尾品种'Professor Neil'叶片叶绿素下降不明显。MDA、Pro、SOD、POD、CAT含量和O2-产生速率普遍随着Pb处理浓度0-400 mg/L增加而缓慢上升,表明适度的Pb胁迫可通过植物体内抗氧化酶和抗氧化物质的诱导合成得到缓解,但在600-800mg/L时表现急剧上升或下降,表明高浓度处理诱导植物代谢加快或受到不可逆的伤害。Pb胁迫下随着0-600 mg/L浓度的升高和1-7 d时间的推移,GSH和Cys含量逐渐增加并产生显著差异,尤其GSH起着重要的Pb解毒作用。3.采用高通量测序技术分析了路易斯安那鸢尾品种'Professor Neil'根部Pb处理后的转录响应情况,共计获得150,328,034个读取(reads),组装了 562,409个转录本(Transcript)和350,869个Unigene,其中有50.72%的Unigene在公共数据库中有注释。对已注释的Unigene进行分类和功能分析,有58,722个Unigene注释能到KOG数据库,涉及25个功能类别;有102,265个Unigene在GO数据库中有注释,共分为3个生物本体过程(ontology);有13,204个Unigene参与了 52个上调KEGG代谢通路,有15,666个Unigene参与了 102个下调KEGG的代谢路径。差异基因的表达分析指出,在Pb处理和对照中,共检测到3,869个显著变化的基因,其中1,850个上调表达,2,019个下调表达;在整个代谢通路中有2类植物络合素合成酶(PCS)、1类3型金属硫蛋白、4类Nramp金属转运蛋白、2类转录因子的基因被显著差异表达。RT-qPCR检测了 12个路易斯安那鸢尾响应Pb胁迫相关基因的表达,进一步支持和验证了 Pb胁迫相关基因的活性和转录组测序的可靠性。4.通过对路易斯安那鸢尾转录组进行分析,获得LiPCS1的中间片段,利用RACE技术分别克隆与拼接,全长为1,683 bp,预测编码蛋白质含501 aa,蛋白质含有Cys-56、His-162和Asp-182三个必需的氨基酸活性位点和重金属离子传感器基序C368C369RMTC373VRC376,与其他同源PCS进行保守性分析发现相似位点达91.6%。路易斯安那鸢尾LiPCS1在内花瓣表达最高,与其他组织产生显著差异,雄蕊、叶和茎的表达量基本在同一水平,外花瓣、根和雌蕊表达较低,雌蕊最低。随着铅处理时间增加,LiPCS1在根系和叶片中表现先升高后下降的趋势,在3h时达到最大值而产生了显著差异。5.获得Nramp基因家族中路易斯安那鸢尾 LiNramp2、LiNramp3、LiNramp5、LiNramp6的中间片段,利用RACE技术分别克隆到LiNramp2、LiNramp3、LiNramp5和LiNramp6基因,全长分别为1,786、2,082、2,090、2,142bp,预测编码蛋白质分别含519、546、544、539 aa,蛋白质具有11或12次跨膜结构域,与其他同源Nramp进行保守性分析发现相似位点80%以上,表明LiiNramp同其他同源基因保守性很高。LiNramp家族在路易斯安那鸢尾叶片和雄蕊中表达较高,一直在雌蕊中表达最低,根和茎表达量差别不大,根稍高于茎。随着Pb处理时间增加,LiNramp2基因在根系中的表达量缓慢下降,在叶片中的表达量呈现先升高后下降的趋势,总体上没有显著差异,LiNramp3、LiNramp5、LiNramp6基因在根系和叶片中的表达量都呈现出先下降后上升的趋势,产生了显著差异。
【图文】：

植物细胞,重金属,拟南芥

植物中发现的Ｐｂ耐受相关转运蛋白主要包括ＮｔＣＢＰ４转运子和ＡＢＣｍｚｉ等（１９９９）在植物中发现了一种特殊的质膜通道钙调蛋白ＮｔＣＢＰ４，２＋通过质膜进入细胞内部，进一步通过转基因将这一蛋白在其他植物上过进了植物对Ｐｂ的吸收。而ＭＣＡＰ４基因编码一个植物钙调素，于２０００和拟南芥中分离得到，并被证明其负责Ｐｂ２＋通过质膜通道向胞内运输（Ｓｕｎ００）。ＭＣ５Ｐ４过量表达，转基因烟草地上部分Ｐｂ含量明显增加，同时对增强。转ＭＣ５／＾ｚｌＣ：（去除Ｃ端ＣａＭＢＤ结构域和环核苷酸结合域）基耐受性提高。Ｔ－ＤＮＡ插入破坏拟南芥ａＶＧＣｉ基因（ＭＣ５Ｐ４同源基因）了对Ｐｂ的耐受性。ＡＢＣ转运蛋白主要包括酵母ＹＣＦ１和拟南芥ＡＢＣ亚族Ｇ功能蛋白。７ＣＦ／基因编码一个液泡膜转运体，承担将异质物转运ｏｎｇ等（２００３）发现超表达酵母７ＣＦ／基因的拟南芥和酵母突变体（ＤＴＹ１Ｐｂ的耐性，且积累更多量的Ｐｂ。通过农杆菌介导遗传转化将ｙｃＦ／基物量的芥菜（Ａ逦中。转基因芥菜植株铅浓度高于野生型１．６倍，铅的积累量高于野生型１．７至ＩＪ２．２倍（Ｂｈｕｉｙａｎｅｔａｌ．２０１１ａ）。它ＦＣＦ７的转基因植物可以用来修复铅污染。ＡｔＡＴＭ３／ＡｔＨＭＡ３属于ＡＢＣ亚家

路易斯安那,应用效果,主要特征

６本研究的目的和主要研究内容逡逑本文以具有适合湿地栽培、生长速度快、生物量大、适应性广、抗性强、观赏性逡逑好等特性的路易斯安那鸢尾（Ｌｏｕｉｓｉａｎａ邋ｉｒｉｓ）为材料（图１－３），从植物的Ｐｂ吸收、逡逑富集特性、积累的细胞学、生理生化影响以及植物Ｐｂ响应及其调控的理机制研究，逡逑为进一步培育高效选择性吸收和积累重金属离子应用型超积累植物新种质研究提供逡逑理论依据。逡逑本研究在以往对鸢尾属植物重金属抗性等研究的基础上，试验设计如图１－２，开展逡逑的主要研究内容包括：一、从引进的路易斯安那鸢尾品种中筛选铅富集能力强的抗性逡逑品种，通过不同浓度铅处理从生长、显微结构上观察路易安那鸢尾的富集特性，评价逡逑耐性、抗性和富集能力；二、从通过不同浓度铅处理对耐铅品种根系和叶片生理生化逡逑代谢的影响分析植物富集和耐性发生的理化基础；三、采用高通量测序ＲＮＡ－Ｓｅｑ技术逡逑分析铅处理下的路易斯安那鸢尾植物根转录响应差异，统计分析相关的差异表达基逡逑因；四、利用转录组得到的序列与ＲＡＣＥ的方法，克隆与重金属吸收、螯合和转运有逡逑关的ＰＣＳ、ｉＶｍ—等基因，运用生物信息学方法对其推测的氨基酸序列进行序列比对、逡逑系统进化树和跨膜结构域分析，研究其组织特异性表达以及对铅胁迫的响应以及基因’逡逑调控机理机制。逡逑路易斯安那鸢尾＾逡逑Ｐｂ吸收积累特性逦逦逡逑ｐ＾－ｉ邋ｒ＾－ｉ逦丨邋１邋
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X52;X173;S682.19

【参考文献】