水稻和荞麦抗铝毒转录因子ART1调控机制的研究

发布时间：2020-06-07 16:55

【摘要】：铝毒害是植物在酸性土壤上生长的主要限制因子之一。植物在长期适应酸性土壤过程中发展出了多种应对铝胁迫的解毒机制,如分泌有机酸解铝毒,利用液泡将铝隔离等。而参与这些重要的解铝毒过程的基因在水稻和拟南芥中都受转录因子ART1/STOP1的调控。ART1基因的表达不受铝毒影响,但它下游受调控的抗铝毒基因的表达受铝毒诱导,因此可能存在与ART1进行互作的蛋白共同来调控下游抗铝毒基因的表达。本文利用酵母双杂交系统筛选能与ART1相互作用的蛋白,以期对ART1的调控机制有进一步了解。荞麦是一种高抗高积累铝的植物,能在酸性土壤上生长至叶片铝含量15000 ppm而不表现出铝毒害症状。然而由于基因组序列的缺少,荞麦内在的分子机制基本是一片空白。本文利用高通量测序技术对苦荞转录本进行测序,并对苦荞中的ART1和ART1下游基因ALS1的同源基因进行研究。本文的主要研究结果如下:(1)构建了总克隆数1.5×105CFU、平均插入片段长度1 K的cDNA均一化文库构建。通过酵母双杂交对cDNA文库进行筛选,得到22个ART1的候选互作蛋白。根据基因注释信息对候选蛋白初步筛选,选定10个候选蛋白,并通过互换诱饵蛋白和捕获蛋白的载体,在酵母中进行互作确认,结果发现,一种含单个锌指结构域的转录因子OsVOZ1在酵母中与ART1表现出较强的互作,其同源蛋白OsVOZ2在酵母中自激活。Split-LUC方法在烟草细胞内证实OsVOZ1和OsVOZ2分别具有与ART1互作的能力。实时定量RT-PCR表明OsVOZ1和OsVOZ2的表达不受铝的诱导。为研究OsVOZ1和OsVOZ2是否参与水稻抗铝毒,对水稻osvoz1和osvoz2突变体进行研究,发现OsVOZ1和(OsVOZ2单突变不影响水稻的铝敏感性。双突株系osvoz2;OsVOZ1-Ri会使水稻正常根伸长变短,然而铝处理条件下其根长显著长于野生型,说明OsVOZ1和OsVOZ2双突增加植株的铝抗性。osvoz2;OsVOZ1-Ri株系中ART1的表达受铝诱导上调,暗示OsVOZ1和OsVOZ2可能作为ART1的负调控因子参与水稻抗铝毒。拟南芥atvoz1atvoz2抗铝性的增加揭示VOZ1和VOZ2在水稻和拟南芥抗铝毒过程中的功能具有一定保守性。(2)对苦荞转录本进行测序并重新组装、去除冗余序列,最终得到约40000个高质量的转录本。对苦荞根尖和基部样品的RNA-seq数据进行分析,发现铝处理会优先诱导作用于抵抗细胞壁毒性和氧化应激的基因的表达,同时,参与三羧酸循环的关键酶基因的表达都没有显著改变,暗示有机酸代谢过程可能不是铝诱导的有机酸分泌的限速步骤。柠檬酸在荞麦铝转运过程中起至关重要的作用,从荞麦转录组中鉴定出两个 MATE 家族的基因,FtFRDL1 和 FtFRDL2,FtFRDL1 和 FtFRDL2 都属于 FRD3亚家族且都受铝诱导上调表达,暗示了它们很有可能参与铁和铝向地上部的运输。另一方面,在水稻和拟南芥中保守且只有单个拷贝的耐铝基因ART1/STOP1、ALS1和STAR1在苦荞中均有两个拷贝,猜测这可能是荞麦高抗高积累铝的重要原因。(3)荞麦中ART1的同源蛋白FtARL1和FtARL2跟STOP1/ART1 一样,都含有四个高度保守的C2H2锌指结构域。进化树分析发现FtARL1和FtARL2跟拟南芥STOP1更近。表达分析结果表明:FtARL1在根部的表达不受铝的诱导,而FtARL2的表达受铝诱导略有上调。将YFP分别与FtARL1和FtARL2的N端和C端融合,在烟草表皮细胞中表达融合蛋白,结果显示FtARL1同时定位于细胞核和细胞质,而FtARL2只定位于细胞核。上述结果暗示了 FtARL1和FtARL2在荞麦中可能行使不同的功能。通过将FtARL1导入拟南芥stop对突变株中,发现表达FtARL1的回复突变株能够完全回复STOP1突变导致H+敏感性,部分回复铝敏感性,这跟相关受STOP1调控的H+和铝抗性基因的表达回复一致。(4)ALS1在荞麦中有两个同源基因,FtALOL1和FtALOL2。FtALOL2在根部的表达能够专一、灵敏地受铝的诱导上调,10 μM铝即能完全诱导FtALOL2的上调;而FtALOL1对多种金属离子有响应:铝处理能下调FtALOL1表达,Cu处理使FtALOL1表达上调。为研究FtALOL1的组织表达模式,将2 kb FtAOL1的启动子与GUS报告基因融合,并利用发根农杆菌将其导入荞麦并最终得到转基因的毛根,GUS染色结果表明:FtALOL1主要在中柱表达。将YFP分别与FtALOL1和FtALOL2的N端融合,在烟草表皮细胞中表达融合蛋白,结果显示FtALOL1定位于细胞膜,而FtALOL2在烟草中出现错误聚集。酵母异源表达实验结果显示FtALOL2在酵母中具有铝转运活性。拟南芥回复突变株als1-1;FtALOL1跟alsl-1的铝敏感性没有显著差别,而FtALOL2的表达增加了拟南芥的铝敏感性。综上所述,ART1互作蛋白OsVOZ1和OsVOZ2可能作为ART1的负调控因子参与抗铝毒过程,且OsVOZ1和OsVOZ2功能存在冗余。VOZ1和VOZ2在拟南芥和水稻解铝毒方面中具有一定保守性。高抗高积累铝作物苦荞中ART1及下游基因ALS1均存在两个拷贝,且两个拷贝之间的表达定位模式存在分化,提示苦荞中ART1和ALS1同源基因通过进化不同的功能来应对该作物对铝的抗性和运输。
【图文】：

ＵＡＳ－Ｇａｌ２邋ＴＡＴＡ－Ａｄｅ２邋ＵＲＡ３：：ＭＥＬ１邋ＵＡＳ＾Ｍｅｌｌ邋ＴＡＴＡＡＵＲ１－ＣＭＥＬＩ）。逡逑载体：ｐｉ＾ＳＦ－Ｂｌｕｎｔ购于ＴｒａｎｓＧｅｎ邋Ｂｉｏｔｅｃｈ；用于酵母双杂交系统的ｐＧＢＫＴ７和ｐＧＡＤＴ７逡逑的载体图谱如图２－１。逡逑生物试剂：２邋ｘ邋Ｔａｑ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ、ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ？邋ＩＩ邋Ｏｎｅ邋Ｓｔｅｐ邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋Ｋｉｔ邋和邋ＨｉＳｃｒｉｐｔ？邋Ｉｓｔ逡逑Ｓｔｒａｎｄ邋ｃＤＮＡ邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋Ｋｉｔ购自Ｖａｚｙｍｅ公司；限制性内切酶均购自Ｂｉｏｌａｂｓ公司；Ｔ４逡逑连接酶、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬ高保真酶和酵母营养缺陷型培养基购于Ｔａｋａｒａ公司；胶回逡逑１３逡逑

由于ＡＲＴ１在酵母中具有潜在的转录激活活性，因此首先通过酵母单杂交实验找逡逑出ＡＲＴ１的自激活位点。将ＡＲＴ１进行６种不同长度和位置的截短，将其构建至逡逑ＰＧＢＫＴ７，分别命名为Ｔ１至Ｔ６，构建载体示意图及酵母单杂交的点板结果如图２－４：逡逑跟之前报道的结果一致，含空载ｐＧＢＫＴ７的酵母在ＳＤ－Ｔｒｐ的培养基上生长良好，逡逑在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ及ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ的选择培养基上则不能生长，而表达ＢＤ－ＡＲＴ１的酵逡逑母能在ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ及ＳＤ－Ｔｒｐ－Ｈｉｓ－Ａｄｅ的培养基上生长，证实ＡＲＴ１具有自激活功能逡逑（Ｙａｍａｊｉ邋ｅｔａｌ．，邋２００９）。将ＡＲＴ１分害ＩＪ为不含锌指的前半段（Ｔ１）和包含全部锌指的后逡逑半段（Ｔ２），，结果表明含有锌指区的后半段表现出了自激活能力，因此我们认为激活逡逑位点在后半段；对ＡＲＴ１重新进行分段，分为包含一个锌指区的前半段（Ｔ３）及包含逡逑三个锌指的后半段（Ｔ４），结果发现Ｔ３没有激活能力，而Ｔ４能自激活；对Ｔ４再次逡逑分段
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511;S517;X503.231

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本文编号：2701722