白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究

发布时间：2020-06-13 12:03

【摘要】：本论文以白腐菌木质素降解酶为研究对象，从十二株白腐菌中筛选产木质素降解酶能力强的菌株，利用层析技术将木质素降解酶分离纯化，并进一步了解该酶的基本酶学性质和特性，用于蒽醌染料SN4R的脱色研究，同时考察了产漆酶白腐菌对造纸碱木素的脱色能力。 所试白腐菌在限氮条件下未发现有锰过氧化物酶和木素过氧化物酶的生成，主要产生的木质素降解酶为漆酶。其中产漆酶能力最强的是侧耳(Pleurotus ostreatus 324)；次之为侧耳(Pleurotus ostreatus)青岛黑，杏鲍菇(Pleurotus eryngii)，侧耳(Pleurotus ostreatus)5526；产漆酶能力较低的有香菇(Lentinus edodes9608)，以及侧耳(Pleurotus ostreatus)中的792、G1、G5和鲍鱼菇；而杂色云芝(Polyporus versicolor)，灰管层孔(Fomes lignosus)，草菇(Votvariella volvcea)在此条件下不产漆酶。在富氮培养条件下，未发现有木质素过氧化物酶的生成，主要木质素降解酶为漆酶和锰过氧化物酶．在富氮培养条件下白腐菌产漆酶能力明显低于限氮条件下产漆酶能力，高浓度的氮对漆酶生产有抑制作用。 糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus 324)在限氮条件下产漆酶能力较强，本论文研究了该菌的产漆酶能力，并进行了酶学性质和应用性研究。白腐菌真菌Pleurotus ostreatus 324最佳产漆酶条件为：静置条件下培养，温度为30℃，培养基初始pH为5，三角瓶装液量为20ml／250ml。在所有测试碳源中，纤维二糖、阿拉伯糖为最佳碳源；在氮源中，有机氮要优于无机氮，如蛋白胨、酵母膏、酒石酸铵、尿素都是漆酶生产的良好氮源，当培养基C／N＞10：1即高碳低氮培养条件下，有利于漆酶的形成；产酶培养基中添加0.5mmol%rL浓度的不同金属离子，其中Ca~(2+)，Ca~(2+)有助于漆酶的产生；添加诱导剂ABTS(0.5-1mM／L)对漆酶的活性影响最明显，，与对照相比可提高漆酶酶活5倍，约为410 U／ml。该酶产量明显高于国内外同类文献报道，白腐菌Pleurotus ostreatus 324是漆酶的优良生产者，具有很高的实际应用价值。 白腐菌Pleurotus ostreatus 324漆酶，经三步层析分离，纯化为电泳级，纯化倍数为26.5倍，回收率为38.3％。该漆酶单个亚基分子量为56.5kD，自然分子量为56kD。该酶在醋酸缓冲液中最适反应pH为3.5，最适反应温度为65℃，在醋酸缓冲液(pH5.0)中，反应温度低于50℃时，漆酶非常稳定；该漆酶能氧化ABTS和各种酚类化合物，尤其是对对位和邻位甲氧基取代酚的氧化能力强，羟基取代酚次之，而对氨基取代酚、阿魏酸和焦醅酚的氧化能力相对较弱；叠氮化钠对该漆酶有强烈的抑制作用。与其它真菌漆酶相比，无论是在分子量大小上，还是在酶学性质上都明显不同，可初步断定Pleurotus 大连理工大学博士学位论文 ostreatus 324漆酶为一新的真菌漆酶。 漆酶是一种含铜多酚氧化酶，可催化酚类化合物和芳香胺的氧化，在小分子介体物 质存在下，漆酶氧化范围可进一步扩大。葱醒染料活性艳蓝SN4R可被该粗漆酶(30U/m1) 直接脱色，脱色最佳pH值为4.0，40℃为最佳脱色温度，脱色时间为12小时，脱色率 为55%，但酶活与染料脱色率不呈正比关系。经一系列SN4R脱色的对比实验，发现纯漆 酶和小分子物质ABTS分别单独使用时，都不能使蕙醒染料SN4R脱色，当纯漆酶中添加 小分子介体物质ABTS时，可使SN4R脱色;显然葱醒染料SN4R不是漆酶底物，小分子还 原介体可介导漆酶与非酶底物染料之间的氧化作用，而使染料脱色。小分子介体物质 ABTS、对一甲氧基酚、黎芦醇的添加，有助于染料脱色率的提高以及脱色时间的缩短，添 加一定浓度的对一甲氧基酚或黎芦醇后，染料SN4RZ小时的脱色率可达8既以上。 白腐菌分泌胞外氧化酶一木素降解酶。这类氧化酶底物专一性不强，除降解木质素外 还降解大量的芳香族污染物。首先观察了四种白腐菌Pleurotus eryng王i，PolyPorus versicolor，尸leurotus口streatus和Fomesl妙osus在限氮和富氮培养基中振荡培养产木素过 氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的能力，由于尸leurotus ostreatus和尸leurotus eryng王i产酶 能力较强，用于碱木素的降解脱色效果较好，二者在限氮条件下n天对碱木素降解脱色 率为65%和72%。对于Pleurotus ostreatus犯4来说，0.69/L CaZ+有助于该菌体生物量的增 加，对其产酶影响不明显;10mg/L Mn2+有助于该菌锰过氧化物酶活性的提高;smg/L Cu2+ 可显著提高该菌产漆酶能力，10天可使碱木素的降解脱色率达到90%。
【图文】：

大连理工大学博士学位论文ha200150100图3一1一第二次离子交换层析色谱图Fig.3小4Chromatogr叩hieeurveson.ionexehanger.Colulnn:Q一SePharose(XL16/50).SamPle:elutedPeaksfromColumnSePhadexG一75.Startbuffer:20mMTris一HCI，PHS.0.Gradient:0一0.2MNaCIin20m加1Tris一HCI，PHS.0in30columnvolume.Flowrate:lmFmin.SylnbolsofaJ汀ow15theactivePeak2.2白腐菌PI~口亡口‘ostreatu岁324漆酶的分子量通过变性条件下聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一PAGE)测得白腐菌尸leurotus口‘介已atu:324漆酶的分子量为56.5kDa(图3一1一6)。通过非变性条件下凝胶层析测得该酶分子量大约为56kDa。非变性条件下测得分子量与聚丙烯酞胺凝胶电泳所测结果基本一致，可以推断该酶为单聚体蛋白。图3一1一5粗漆酶凝胶电泳图Fig.3小5SDS·PAGEoferudeextractoflaceaseLanel:Moleeularweightmarkers.LaneZ，3:CrUdeeXtract.64

大连理工大学博士学位论文ha200150100图3一1一第二次离子交换层析色谱图Fig.3小4Chromatogr叩hieeurveson.ionexehanger.Colulnn:Q一SePharose(XL16/50).SamPle:elutedPeaksfromColumnSePhadexG一75.Startbuffer:20mMTris一HCI，PHS.0.Gradient:0一0.2MNaCIin20m加1Tris一HCI，PHS.0in30columnvolume.Flowrate:lmFmin.SylnbolsofaJ汀ow15theactivePeak2.2白腐菌PI~口亡口‘ostreatu岁324漆酶的分子量通过变性条件下聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一PAGE)测得白腐菌尸leurotus口‘介已atu:324漆酶的分子量为56.5kDa(图3一1一6)。通过非变性条件下凝胶层析测得该酶分子量大约为56kDa。非变性条件下测得分子量与聚丙烯酞胺凝胶电泳所测结果基本一致，可以推断该酶为单聚体蛋白。图3一1一5粗漆酶凝胶电泳图Fig.3小5SDS·PAGEoferudeextractoflaceaseLanel:Moleeularweightmarkers.LaneZ，3:CrUdeeXtract.64
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：X788

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 赵文生;张凤君;赵勇胜;邓锡斌;;利用白腐菌对山梨酸废水进行预处理的效果研究[J];中国给水排水;2011年07期

2 张营;杨革;;漆酶在工业中的应用研究[J];染整技术;2011年07期

3 张玉龙;池玉杰;闫洪波;;偏肿栓菌产锰过氧化物酶条件优化[J];林业科学;2011年08期

4 熊亚红;高敬忠;郑坚鹏;;提高漆酶稳定性的化学修饰方法的研究[J];化学研究与应用;2011年08期

5 张鑫璐;裴继诚;张方东;于秀玲;胡惠仁;;漆酶和APMP废液中酚类物质共同改善OCC纸浆纤维性能的研究[J];中国造纸学报;2011年02期

6 黄崇杏;杨崎峰;王双飞;;白腐菌改性CTMP浆纤维表面的XPS分析[J];中国造纸;2011年07期

7 张鑫璐;裴继诚;张方东;于秀玲;;漆酶催化不同小分子物质改善纤维性能[J];天津科技大学学报;2011年04期

8 王维乐;牟志美;张淑君;于奇;任春久;赵凯;姚娟;高绘菊;;响应面法优化Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶发酵条件[J];应用与环境生物学报;2011年03期

9 林晓雷;张素风;谢益民;路庆辉;;生物酶催化交联提高纸板湿强度的研究[J];中华纸业;2011年14期

10 范雪荣;王强;王平;袁久刚;;可用于纺织工业清洁生产的新型酶制剂(续一)[J];针织工业;2011年06期

相关会议论文 前10条

1 张晓昱;陈建伟;王宏勋;刘波;;不同黑液体系下白腐菌漆酶诱导分泌研究[A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集[C];2003年

2 张晓昱;黄慧艳;陈龙;;天然木质纤维素中白腐菌漆酶与半纤维素酶的分泌及相互影响[A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集[C];2003年

3 马星霞;段新芳;李家宁;蒋明亮;;木质素真菌漆酶转化法制备胶黏剂研究概况[A];节能环保 和谐发展——2007中国科协年会论文集（三）[C];2007年

4 黄慧艳;张晓昱;;白腐菌对培养环境pH的调节及其产漆酶的相关性[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

5 张晓昱;尹艳丽;王宏勋;;玉米秸秆降解液对白腐菌降解染料的影响[A];生命科学与微生物专辑[C];2004年

6 刘友勋;张晓昱;;白腐真菌漆酶的纯化及其对染料的脱色研究[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年

7 冯义平;毛亮;高士祥;;漆酶去除水体中四溴双酚A的研究[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年

8 张银波;江木兰;胡小加;马立新;;白腐菌漆酶基因的克隆及其在酵母中的表达研究[A];湖北省遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年

9 王宜磊;;产漆酶菌株筛选及其酶性质研究[A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集[C];2003年

10 王婷;杜金梅;林栋;;漆酶结构及其生物降解机制[A];中国环境科学学会2009年学术年会论文集（第四卷）[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 ;大雅之堂[N];中国文物报;2002年

2 赵红霞邋杨建军 詹勇;白腐真菌在秸秆饲料资源开发中的应用前景[N];中国畜牧兽医报;2008年

3 吴茗;新型特种酶令纺织品改性[N];中国纺织报;2005年

4 东华大学 黄茂福;开发低温染整助剂降低能耗[N];中国纺织报;2005年

5 晓蜗;生物技术在制浆造纸中的应用与研究进展[N];中国包装报;2009年

6 余志平 编译;生物机械装置[N];医药经济报;2002年

7 陈瑗;印染业技术攻关成绩不凡[N];中国纺织报;2004年

8 孟晓莉;大漆的防腐性能及应用[N];河北科技报;2003年

9 本报记者 林菲;“生物修复工程”为土壤解毒[N];农民日报;2001年

10 山东省农科院植保所研究员 冯建国提供;白腐病[N];山东科技报;2001年

相关博士学位论文 前10条

1 侯红漫;白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究[D];大连理工大学;2003年

2 杨雪薇;木质纤维素大分子白腐菌改性机制及热解性质研究[D];华中科技大学;2011年

3 吴坤;杂色云芝（Coriolus Versicolor）和杂色云芝漆酶及其对环境污染物降解的研究[D];浙江大学;2002年

4 任大军;白腐菌对氮杂环化合物的降解及机理研究[D];华中科技大学;2006年

5 蒋晓云;几种污染环境下五氯酚的微生物修复研究[D];湖南大学;2009年

6 姬广磊;漆酶在染料脱色和疏水性芳香化合物降解转化中的应用研究[D];山东大学;2009年

7 颜克亮;木质纤维素共基质体系中白腐菌降解污染物研究[D];华中科技大学;2009年

8 王宏勋;白腐菌生物处理草浆碱法蒸煮黑液研究[D];华中科技大学;2004年

9 黄乾明;漆酶高产菌株的诱变选育及其酶的分离纯化、性质和基因克隆研究[D];四川农业大学;2006年

10 王国栋;过量表达棉花分泌型漆酶拟南芥对酚酸类物质和三氯苯酚的植物体外修复[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 宋小双;白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析[D];东北林业大学;2004年

2 赵美丽;白腐菌产漆酶及其对印染污水处理的研究[D];南昌大学;2012年

3 邹建炫;白腐真菌产漆酶对染料废水降解的研究[D];南京理工大学;2004年

4 钱程;白囊耙齿菌（Irpex lacteus）漆酶基因的克隆及相关序列的分析[D];东北林业大学;2005年

5 王艳婕;漆酶高产菌株的筛选及香菇漆酶基因克隆[D];河南农业大学;2004年

6 冯建良;生物预处理对草类原料制浆性能的影响及机理研究[D];南京林业大学;2005年

7 淡明;白腐菌D1漆酶基因的克隆及其表达载体的构建[D];华南热带农业大学;2006年

8 王锦锦;白腐菌混合培养对玉米秸秆酶解糖及热重影响研究[D];华中科技大学;2009年

9 王锦锦;白腐菌混合培养对玉米秸秆酶解糖及热重影响研究[D];华中科技大学;2009年

10 周蕊;滑菇（pholiota namek）漆酶的诱导、纯化、cDNA克隆及表达[D];南京林业大学;2007年

本文编号：2711149