啶虫脒降解菌株的分离、降解关键酶基因克隆及啶虫脒污染土壤生物修复研究

发布时间：2020-06-14 07:48

【摘要】：啶虫脒是一种高效、低毒、广谱的氯代烟碱类杀虫剂,属于新烟碱类杀虫剂。目前,新烟碱类杀虫剂已成为世界第一大杀虫剂,而啶虫脒又是其中重要种类,被广泛用于防治水稻、蔬菜、棉花、果树和茶叶上的蚜虫、蓟马、飞虱以及部分鳞翅目害虫等。由于啶虫脒的广泛使用,并且其水溶性高,极易通过土壤进入地表水和地下水。此外,啶虫脒对蜜蜂等的急性毒性以及在茶叶、棉花上的残留均有报道。微生物参与的代谢是啶虫脒在环境中消除的主要途径。近年来,已有一些关于啶虫脒微生物降解的报道,但其研究内容多集中于降解菌株的分离和代谢途径的研究,对于啶虫脒降解基因研究较少,仅有一个腈水合酶的报道。此外,啶虫脒污染环境生物修复过程中的分子生态学效应未见报道。因此,分离筛选啶虫脒降解微生物菌株资源、阐明啶虫脒的微生物代谢途径、克隆降解关键酶基因以及揭示啶虫脒生物修复中的分子生态学效应,具有重要的理论意义和潜在应用价值。在本论文的研究中,通过连续富集培养的方法,从生产啶虫脒农药厂的活性污泥中分离筛选到一株能够以啶虫脒为唯一碳源生长的高效降解菌株Pigmentiphagasp.D-2,该菌株可在72 h内降解99%以上的50 mg.L-1啶虫脒,其最适生长和降解温度为37℃,最适生长和降解pH值为7。通过HPLC-MS和MS-MS方法研究了菌株D-2对啶虫脒的代谢途径,发现其存在两个不同的起始步骤:啶虫脒C-N键断裂生成1-(6-氯吡啶基-3-甲基)-N-甲基甲胺(命名为IM1-4)和啶虫脒直接脱氯、脱甲基生成N'-氰基-N-甲基-N-(3-吡啶基甲基)甲脒,后者为首次报道。降解啶虫脒的关键酶蛋白(Acetamiprid amidase,Ama)通过硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose FF离子柱层析和Superdex-200凝胶层析3步纯化流程获得。肽指纹图谱鉴定结合菌株基因组框架图测序结果分析,确定编码蛋白的ORF为orf05630,位于Scaffold26上。ORF分析显示Ama由α和β两个亚基组成,将编码α亚基的基因命名为ama1,基因全长372bp,编码123 aa,分子量为13.5 kDa;编码β亚基的基因命名为ama2,基因全长2295 bp,编码764 aa,分子量为84.2 kDa。通过氨基酸序列比对发现,Ama 的 α 和β亚基与Paracoccus aminophilus的N,N-dimethylformamidase 的α和β亚基具有最高的相似性(分别为35%和56%)。设计引物扩增编码Ama两个亚基的序列,构建表达载体pET-29a-ama,转化入E.coli BL21(DE3)中异源表达,纯化的重组酶Ama能够将啶虫脒水解成IM1-4;Ama的最适酶反应温度为37-55℃;最适酶反应pH值为7.5。加入0.1 mM的Al3+、Fe3+、Fe2+和Li+,对Ama的酶活力有一定的促进作用(提高了 8.2%～20.8%左右);0.1 mM的Cu2+能够抑制61.4%的Ama酶活力;0.1 mM的Hg2+能够抑制96.8%的Ama酶活力。在研究菌株D-2对不同土壤中不同浓度啶虫脒的降解时,发现当啶虫脒浓度较低(50mg·kg-1干土)时,酸性土壤(pH5.45)中啶虫脒在40d内的自然降解率为30.2%,中性土壤(pH 6.75)和碱性土壤(pH 7.85)在15 d内的自然降解率分别为39.6%和59.1%。当啶虫脒浓度较高(200mg·kg-1干土)时,酸性土壤中啶虫脒在40d内自然降解24.3%,中性土壤在15 d内自然降解26.7%,碱性土壤在15 d内自然降解48.1%。推测土壤中的土著微生物在啶虫脒的降解过程中发挥作用,且碱性环境有利于啶虫脒的自然降解。接种菌株D-2能够促进啶虫脒的降解。当啶虫脒浓度为50mg·kg-1干土时,接种菌株D-2可以使酸性土壤中啶虫脒在40d的降解率达94.8%,中性土壤中的啶虫脒在15d的降解率为97.5%,碱性土壤中啶虫脒在15d的的降解率为91.2%。当啶虫脒浓度为200 mg·kg-1干土时,接种菌株D-2时,可以使酸性土壤中啶虫脒40 d的降解率达92.5%,中性土壤和碱性土壤中啶虫脒的15d降解率分别为96.1%和89.6%。通过对不同土壤中降解的研究发现,在酸性土壤中有利于菌株D-2降解能力的发挥。利用MiSeq高通量测序技术研究菌株D-2对不同土壤中不同浓度啶虫脒进行生物修复的生态学效应。三种土壤的Alpha多样性分析结果表明,在酸性土壤和中性土壤中施加啶虫脒会减少土壤中微生物群落的丰富度和多样性。而接种菌株D-2可以增加土壤中微生物群落的丰富度和多样性,菌株D-2能够降解啶虫脒去除毒害胁迫效应,丰富土壤中的微生物群落组成。在碱性土壤中,啶虫脒和菌株D-2并不显著影响土壤中微生物群落的丰富度。三种土壤的Beta多样性分析结果表明,施加啶虫脒仅影响碱性土壤的微生物群落结构,而接种菌株D-2则会改变酸性土壤和碱性土壤中的微生物的群落结构。在啶虫脒浓度为200 mg.kg-1干土并接种菌株D-2的情况下,对酸性和中性土壤细菌门水平的分析表明,在酸性土壤中,变形菌门的相对丰度显著增加(35.4%);在中性土壤中,放线菌门的相对丰度有所增加(4.6%)。而对于碱性土壤中,只施加高浓度的啶虫脒会增加变形菌门的相对丰度(11.4%)。根据已报道的啶虫脒降解菌株所在的菌属信息,在土壤细菌门水平上进行分析,发现三种土壤在施加啶虫脒的情况下,假黄单胞菌属的相对丰度会有一定的增加(增长了 0.03%～0.31%);在同时接种菌株D-2的情况下,假黄单胞菌属(增长了 0.02%～0.37%)、假单胞菌属(增长了 0.17%～0.97%)和寡养单胞菌属(增长了 0～0.58%)都会有增加。在施加菌株D-2时,噬染料杆菌属Pigmentiphaga(所占比例为1.25%～24.37%)都是优势菌属,说明菌株D-2在啶虫脒的降解过程中起到关键作用。 【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X592;X172

【图文】：

照片,菌落,菌株,照片

描仪扫描发现，啶虫脒在波长２４５邋ｎｍ处有明显的特征吸收峰（图ｌ－ｌａ）。当啶虫脒逡逑被降解时，相应的特征吸收峰消失。经过反复筛选和验证，最终分离到一株啶虫脒逡逑降解菌，命名为Ｄ－２。菌株Ｄ－２可在７２邋ｈ内对啶虫脒有明显的降解效果（图１－ｌｂ）。逡逑＿：ｊ邋八：逡逑之逡逑图１－１富集液和菌株Ｄ－２对啶虫脒的降解效果（紫外扫描）逡逑ａ：富集液；ｂ：菌株Ｄ－２逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＣＥ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ａｎｄ邋ｓｔｒａｉｎ邋Ｄ－２邋（ＵＶ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ）逡逑ａ，邋Ｔｈｅ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；邋ｂ，邋Ｓｔｒａｉｎ邋Ｄ－２逡逑ａ逦ｂ逡逑．蠢逡逑ｍ逡逑图１－２菌株Ｄ－２的菌落照片（ａ）和电镜照片（ｂ）逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ邋（ａ）邋ａｎｄ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ邋（ｂ）邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋Ｄ－２逡逑２．２降解菌株Ｄ－２的鉴定逡逑菌株Ｄ－２在ＬＢ平板上成黄白色菌落，边缘光滑，菌落凸起，革兰氏染色阴性，逡逑短棒状（０．４￣０．６邋｜0ｍ邋ｘ邋１．１￣１．６邋ｐｍ）（图ｌ－２ａ，图ｌ－２ｂ），好氧，无芽孢，无鞭毛。逡逑提取菌株Ｄ－２的总ＤＮＡ，以ＤＮＡ为模板，利用细菌１６ＳｒＲＮＡ基因的通用引物逡逑进行ＰＣＲ扩增，，得到约为１．５ｋｂ的片段。ＰＣＲ产物回收后与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转逡逑化到五．ｃｏ／ｚ＇ＤＨ５ｃｔ中。挑取阳性克隆子进行测序后提交至ＮＣＢＩ数据库

啶虫脒,代谢产物,菌株,标样

ＡｇＣｌ沉淀，即可检测降解过程中氯离子是否释放（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，邋＆Ｓａｉｎｉｋ，邋１９５７）。逡逑２结果与分析逡逑２．１菌株Ｄ－２对啶虫脒的降解和代谢产物的ＨＰＬＣ检测逡逑接种菌株Ｄ－２至ＭＭＡ培养基中，３０°Ｃ，１６０ｒｐｍ振荡培养，定时取样检测啶脒的含量。由图２－１可以看出，７２邋ｈ内对５０邋ｍｇ．Ｌ－１啶虫脒降解率达９９％以上，并且逡逑

【参考文献】