海洋细菌好氧共代谢降解四溴双酣A机制研究

发布时间：2020-06-18 23:33

【摘要】：四溴双酚A是全球消耗量最大和应用最广泛的溴代阻燃剂之一,由于其持久性、生物蓄积性和生物毒性而受到广泛关注。四溴双酚A广泛分布于各类环境介质中,包括近海海水、沉积物和生物体等。目前,四溴双酚A的生物降解研究主要集中在厌氧转化,而好氧生物降解研究仅局限于陆源微生物,且降解机制研究不充分。迄今为止,尚未有海洋微生物好氧降解四溴双酚A的研究报道。鉴于四溴双酚A在进入厌氧环境前会长期暴露于好氧环境,并与易降解有机物共存,因此开展好氧共代谢生物降解研究对了解四溴双酚A的海洋环境行为具有重要意义。本文针对上述科学问题,基于近海微生物菌群、海洋细菌和响应基因三个层面,对好氧共代谢降解四溴双酚A功能微生物及其降解机制进行深入解析,取得了以下主要研究结果:首先开展了海洋菌群好氧共代谢降解四溴双酚A研究。采用不同共代谢基质富集了近海微生物菌群(即A-H体系),发现不同菌群均具有好氧降解四溴双酚A能力,其中以牛肉膏和蛋白胨作为共代谢基质的菌群(G和H体系)降解能力最强,7天后四溴双酚A降解率均能达到60%左右。利用高通量测序技术对四溴双酚A与不同共代谢基质经120天培养的海洋微生物菌群多样性和结构变化进行分析,发现假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)、深海单胞菌属(Thalassomonas)、超微细菌属(Glaciecola)和伯克氏菌属(Limnobacter)为优势菌属,可能参与好氧共代谢降解四溴双酚A。对H体系通过液相色谱-质谱联用仪分析对四溴双酚A降解中间产物检测,推测出海洋微生物好氧共代谢降解四溴双酚A是通过脱溴和异丙基断裂两条途径同时好氧降解。考察了海洋细菌好氧共代谢降解四溴双酚A特性。从已富集培养的海洋混合菌群(H体系),分离筛选出2株好氧共代谢降解四溴双酚A的纯菌,基于16S rRNA基因序列鉴定,分别命名为Alte omonas acleodii strain GCW和Pseudoalteromonas sp.strain GCY。菌株GCW和GCY好氧共代谢降解四溴双酚A(10 mg/L),降解过程符合准一级动力学反应,速率常数(k)分别为0.27和0.15 d-1,相应的半衰期(T1/2)分别为2.6和4.7天。通过功能菌生理生化特性考察,发现菌株在培养期间,随着四溴双酚A浓度的增加会刺激菌株分泌胞外聚合物来抵御有毒物质对其毒害作用。菌株GCW和GCY共代谢培养在浓度为10 mg/L四溴双酚A作用下,其脱氢酶活性分别提高了3.2和1.6倍,与此同时电子传递活性也均呈现明显上升趋势。通过四溴双酚A降解活性物种定位,发现菌株GCW胞外和胞内提取物中的活性物质对四溴双酚A降解发挥了主要作用,菌株GCY降解四溴双酚A主要发生在细胞外,由胞外酶和非酶活性物质构成。分析了海洋假交替单胞菌好氧共代谢降解四溴双酚A途径。鉴于Pseudoalteromonas sp.strain GCY为兼性菌,其降解四溴双酚A几乎是由胞外活性物种导致,选择菌株GCY作为代表性海洋菌株详细分析其胞外降解过程。对胞外提取物中具有降解四溴双酚A的活性物质通过铁络合和还原实验、活性氧自由基荧光探针检测和电子顺磁共振光谱检测技术,发现在菌株GCY胞外提取物中存在铁载体、过氧化氢、超氧阴离子自由基和羟基自由基。其中,胞外分泌的非酶小分子活性物质具有络合和还原铁的特性;胞外过氧化氢的来源是由于胞外分泌的氨基酸氧化酶催化分解L-氨基酸脱氨的过程所致;胞外超氧阴离子自由基的生成是由呼吸系统中膜相关的NAD(P)H氧化还原酶产生;胞外羟基自由基的产生由Fe(Ⅲ)、铁载体、超氧自由基和过氧化氢导致。高分辨液相色谱-高分辨质谱联用仪分析降解中间产物发现脱溴和异丙基断裂为菌株GCY好氧共代谢降解四溴双酚A的主要途径。基于降解中间产物三溴酚,推测出活性溴自由基参与四溴双酚A降解过程。研究了海洋假交替单胞菌胞外降解四溴双酚A机制。通过对菌株GCY基因组测序和功能基因注释,在基因组中发现L-赖氨酸-ε氧化酶抗菌蛋白LodA(基因lodA)和Na+-转位NADH:醌氧化还原酶(基因nqrA)等与胞外活性氧自由基形成相关的基因。利用反转录荧光定量PCR(RT-qPCR)对上述蛋白相对应的基因lodA和nqrA进行定量表达分析,发现菌株GCY在有/无四溴双酚A(10 mg/L)培养体系培养至稳定期时,基因lodA分别上调61.0和93.4倍,基因nqrA分别上调1.7和2.1倍,证实了基因lodA和nqrA分别参与菌株胞外产过氧化氢和超氧自由基的过程。由所获得的实验结论及热动力学角度分析推测出假交替单胞菌GCY可通过三个途径胞外好氧降解四溴双酚A:超氧自由基直接脱溴、Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)-铁载体与过氧化氢产生的Fenton-like反应和铁催化的Haber-Weiss反应。此外,在陆域微生物系统中也发现了相似的胞外降解机制。开展了陆域细菌(Pseudomonas sp.fz)好氧共代谢胞外降解TBBPA研究,推测出胞外寡肽螯合Fe(Ⅲ)还原成寡肽螯合Fe(Ⅱ)与过氧化氢驱动胞外源于生物的Fenton-like反应降解四溴双酚A为陆域细菌fz胞外降解四溴双酚A的机制。发现陆域菌株fz好氧共代谢降解四溴双酚A过程发生了明显膜损伤,随着培养时间延长,膜损伤越严重。海洋菌株GCY膜完整性分析发现该菌株未受到明显膜损伤可能的原因是通过胞外聚合物和胞内过氧化氢酶共同应对胞外氧化压力。基于海洋细菌GCY与陆域细菌fz共代谢四溴双酚A的胞外降解机制比较,发现铁载体、培养体系pH变化、超氧阴离子自由基、溴离子来源及细胞膜完整性为海洋与陆域细菌好氧共代谢降解四溴双酚A主要差异;海洋与陆域细菌好氧降解四溴双酚A均为共代谢过程、主要发生在胞外、活性物质(铁载体和活性氧物种)通过Fenton-like降解四溴双酚A为二者共性。综上,本论文结果表明海洋细菌可好氧共代谢降解四溴双酚A,发现了胞外共代谢降解的新机制,揭示了胞外活性氧物种对近海生态环境中四溴双酚A环境归趋的重要作用。该研究成果可为自然环境和人工修复系统中微生物降解四溴双酚A及其它有机污染物提供新的启示,同时为研发高效生物修复新工艺提供理论依据。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X172;X703
【图文】：

六溴环十二烷,四溴双酚,二苯醚,化学结构式

在溴代阻燃剂中，四溴双酸Ａ邋（ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｂｉｓｐｈｅｎｏｌ邋Ａ，邋ＴＢＢＰＡ）、多溴二苯醚逡逑（ｐｏｌｙｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ邋ｄｉｐｈｅｎｙｌ邋ｅｔｈｅｒｓ，ＰＢＤＥｓ）和六溴环十二烧（ｈｅｘａｂｒｏｍｏｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ，逡逑ＨＢＣＤ）是目前国内外消耗量大的三种阻燃剂，结构式如图１．１所示，它们通常作为反逡逑应型或添加型用于多种聚合材料中［３］。其中，ＴＢＢＰＡ占据全球溴代阻燃剂销售市场的逡逑６０％左右，同时也是产量最大和应用最广泛的溴代阻燃剂之一［４］。ＴＢＢＰＡ被广泛应用于逡逑环氧树脂和丙稀腈－丁二稀－苯乙稀共聚物（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ邋ｂｕｔａｄｉｅｎｅ邋ｓｔｙｒｅｎｅ，ＡＢＳ）中，这逡逑些聚合物常用于生活中的各类消费品，如电子和娱乐设备等。逡逑Ｈ３Ａｈ３逦Ｘ，１－１。逦＾逦ｉｒ逡逑ＴＢＢＰＡ逦ＰＢＤＥｓ逦ＨＢＣＤ逡逑图１．１四溴双酚Ａ、多溴二苯醚和六溴环十二烷的化学结构式逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ＴＢＢＰＡ，邋ＰＢＤＥｓ，邋ａｎｄ邋ＨＢＣＤ逡逑ＴＢＢＰＡ学名为４，４’－异丙叉双（２，６－二溴苯酚），外观白色固体粉末，分子量为５４３．８，逡逑化学式为Ｃ１５Ｈ１２0２Ｂｒ４。在ｐＨ为中性条件下

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ邋ｆｌａｍｅ邋ｒｅｔａｒｄａｎｔｓ邋ｉｎ邋ｃｏａｓｔａｌ邋ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ１４５５逡逑（８）四溴双酚Ａ在生物质中的分布逡逑ＴＢＢＰＡ具有高亲脂性，会通过多种途径并最终富集在生物体内。有报道发现，在逡逑采集的挪威鸟蛋样本中ＴＢＢＰＡ含量为１３邋ｐｇ／ｇ邋ｄｗ，推测其来源于海鸟母体［４７］。Ｚａｃｓ等逡逑在拉脱维亚的野生动物马鹿、野猪和驼鹿样本组织中检测出ＴＢＢＰＡ含量为０．５２－４．５４逡逑ｐｇ／ｇ邋ｗｗ，指出在上述动物肝脏组织中ＴＢＢＰＡ的含量要高于肌肉组织［４８］。此外，研宄逡逑者采集了中国上海不同区域的树皮，经检测发现ＴＢＢＰＡ在各区域树皮中的平均浓度为逡逑２８０邋ｎｇ／ｇｌｗ［４９］。Ｙａｎｇ等在中国巢湖采集受重度污染工业区的鱼类，结果显示ＴＢＢＰＡ在逡逑鱼体的肾脏、肝脏、肌肉和脂肪样本中的含量分别在７５．２－１２６．４邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ、１６－３７．５邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ、逡逑６．３－４６．０邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ和１２－２１．９邋ｎｇ／ｇ邋ｄｗ之间，这一结果很可能与巢湖水体受ＴＢＢＰＡ污染密逡逑切相关［２９］。Ｔａｎｇ等报道广东省清远市某一池塘（电子垃圾设施旁）中鲮鱼和乌鳢体内逡逑ＴＢＢＰＡ的浓度分别为４．３和９．７邋ｎｇ／ｇ邋ｌｗ＿。逡逑Ｇｕ等在韩国某养殖区的双贝壳（牡蛎和贻贝）中检测到ＴＢＢＰＡ的浓度在ｎ．ｄ．－１５８逡逑ｎｇ／ｇ邋ｌｗ之间［３９］。Ｇｕｏ等检测中国青岛近海特有贝类ｔ节孔扇贝（Ｃ／ｚ／ａｗ＞＾／ａ／ｒｅｒ／）中逡逑ＴＢＢＰＡ的含量，结果发现ＴＢＢＰＡ的浓度范８．５－２１．７５邋ｎ／＿。Ｌｏｅｚ

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