煤烟型大气污染物诱导线粒体凋亡通路及纤维化分子机制研究

发布时间：2020-06-21 02:30

【摘要】：我国是燃煤大国,二氧化硫(SO_2)、多环芳烃(PAHs)和细颗粒物(PM_(2.5))均可由化石燃料的不完全燃烧产生,是典型煤烟型大气污染物中的重要组成成分,也是影响我国空气质量的主要因素,可引起心肺系统损伤和相关疾病。线粒体凋亡参与多种疾病的病理生理过程,主要表现为抗凋亡家族Bcl-2的激活及p53的积累及活化,线粒体功能障碍和氧化应激是其主要诱因。国内外报道指出,SO_2和PAHs单独暴露均可导致小鼠线粒体结构和功能紊乱,活性氧自由基(ROS)产量增加以及线粒体凋亡的发生。但是关于二者复合暴露对线粒体损伤及凋亡的研究鲜见报道。另外,上皮细胞的凋亡失衡、炎症反应和氧化应激还可诱导纤维化的发生。流行病学调查资料显示,作为雾霾主要成因的PM_(2.5)吸入与敏感人群心血管疾病(CVD)易感性的增加有关。纤维化是CVD发生的早期症状。PM_(2.5)可通过肺-血液系统直接或间接作用于心脏,诱导心肌纤维化,影响心脏功能,增加心血管疾病风险。然而上述结果多源于病理研究,缺乏对致病机理的深入解析。为此,本课题拟建立复合暴露动物模型,探讨煤烟型大气污染物诱导线粒体损伤及凋亡机制;并从体内动物和体外细胞培养实验两方面对其诱导心肺纤维化的分子机制展开研究。结果表明:(1)SO_2衍生物NaHSO_3(0、10、30、100μM,24 h)处理大鼠原代心肌细胞,显著上调了ROS产量,引起氧化应激,导致线粒体膜电位降低,抑制线粒体呼吸链复合酶Ⅳ和Ⅴ亚基及相关调控基因的表达,致使ATP含量降低,线粒体功能紊乱。此外,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NALC)可有效缓解NaHSO_3诱导的上述效应,并逆转线粒体结构异常和功能紊乱。(2)7 mg/m~3 SO_2动态吸入(6 h/d,暴露4周)和40 mg/kg b.w.苯并(a)芘(BaP)腹腔注射(前5天)复合暴露诱导C57BL/6小鼠心肺线粒体损伤及凋亡。呼吸链复合酶亚基及相关调控基因表达的下降,导致线粒体DNA损伤及功能受损,进一步激活凋亡途径,表现为抗凋亡基因bcl-2表达下降和促凋亡基因bax上升,同时伴随着抑癌基因p53的积累。(3)SO_2和BaP复合暴露后在停止暴露后不同时间可分别诱导促凋亡和抗凋亡效应。基于前期复合暴露模型,我们发现在暴露结束后1天时,SO_2和BaP共同处理可诱导小鼠肝脏线粒体凋亡通路。此过程伴随着线粒体呼吸链复合酶亚基表达降低和线粒体膜电位的下降,这一结果导致线粒体结构和功能紊乱。膜电位的下降进而激活Bcl-2家族,导致抗凋亡基因bcl-2表达下降和促凋亡基因bax上升,抑癌基因p53积累和磷酸化又加剧了这一效应,最终诱导Caspase级联效应及caspase-3的活化,引起细胞凋亡。而在暴露结束后恢复13周时,复合暴露可诱导小鼠抗凋亡信号,表现为bcl-2过表达及p53的抑制。抗凋亡信号可能是细胞逃避凋亡的一种状态,是癌前病变的早期征兆。(4)肺上皮细胞凋亡会促进炎症和纤维化的发生。基于上述复合暴露动物体内实验,体外细胞实验通过拟合曲线揭示SO_2和BaP的协同作用。SO_2和BaP共同处理可诱导肺纤维化发生,表现为病理学改变及纤维化标志物蛋白表达的上调。通过体内和体外实验结果可知,SO_2和BaP可抑制mir-30c-1-3p的表达,诱导转化生长因子β(TGFβ)受体Ⅱ型(TGFβR2)表达的升高。双荧光素酶报告实验证实mir-30c-1-3p在人类TGFβR2基因的3'-非翻译区(UTR)存在结合位点。(5)建立3 mg/kg b.w.PM_(2.5)暴露动物模型(隔天一次,口咽吸入,暴露4周)和3μg/mL PM_(2.5)体外细胞模型,发现PM_(2.5)可诱导小鼠血清、肺和心脏组织中促炎因子白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度的上调,引起炎症反应,证实肺细胞因子释放引发全身性炎症的可能性;此外,PM_(2.5)暴露在体内和体外引起ROS积累,诱导氧化应激。以上炎症反应和氧化应激都可引起促纤维化细胞因子TGFβ的释放,进而诱导NAPDH氧化酶4(NOX4)参与的氧化还原途径,激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,引起心肌纤维化,最终导致心脏功能紊乱。相关抑制剂/siRNA的处理可有效逆转PM_(2.5)诱导的纤维化效应,同时揭示TGFβ/NOX4/ROS/p38 MAPK可能是PM_(2.5)暴露诱导心肌纤维化的其中一条途径。在本研究中,一方面我们通过体内外实验,阐明煤烟型大气污染物可诱导线粒体损伤及凋亡,且在暴露停止后恢复不同时间时可分别诱导促凋亡和抗凋亡效应;另一方面,从microRNA角度揭示了煤烟型大气污染物诱导心肺纤维化分子机制中传统TGFβ通路的上游分子事件,并借助双荧光素酶实验和抑制剂处理进行了验证。这些研究不仅为煤烟型大气污染物诱导线粒体损伤提供依据,而且为污染高发区易感人群心肺疾病预防和预后建立分子生物标志。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X51
【图文】：

013-2017年全国四种常规污染物浓度变化势Figure1.1Theconcentrationtrendoffourconventionalpollutantsfrom2013to2017

煤烟型大气污染物诱导线粒体凋亡通路及纤维化分子机制研究

017年338个城市三项污染物不同浓度间城市比例[6]

【参考文献】