氯嘧磺隆降解菌的降解特性和应用研究

发布时间：2020-06-28 03:45

【摘要】：氯嘧磺隆是美国杜邦公司在上世纪80年代初期开发的磺酰脲类除草剂,由于其具有杀草谱广、可混性强、活性高等特点,一直是大豆田除草剂的主要品种。但该除草剂残留期长(pH8时DTso 160 d),在自然条件下很难快速降解,其在环境中的残留对后茬敏感作物的药害,造成经济损失。因此了解氯嘧磺隆对土壤微生物的影响,研究氯嘧磺隆污染土壤的微生物修复,解除其残留药害问题,具有十分重要的理论和现实意义。本文从长期受氯嘧磺隆污染的土壤中分离到一株对氯嘧磺隆具有较高降解能力的细菌菌株LW4,对LW4菌株和本实验室保存的另一株降解菌LW3进行了比较研究,对降解能力更强的LW3菌株降解氯嘧磺隆过程中产生的降解产物进行了鉴定,并在此基础上推断了LW3菌株对氯嘧磺隆的降解途径。本文还从土壤可培养微生物和土壤酶活性两个方面探讨了氯嘧磺隆对土壤微生物的影响及其毒性效应,研究了氯嘧磺隆在不同土壤中对玉米的药害程度,并将LW3用于对土壤残留氯嘧磺隆进行降解及恢复敏感作物玉米的生长,为评价氯嘧磺隆的生态环境安全性提供了有益的科学依据。本研究所获的主要结论如下：从污染土壤中分离筛选得到一株氯嘧磺隆降解菌LW4,7d内对50 mg·L-1的氯嘧磺隆降解率达到67.6%,经培养特征,生理生化特性,碳源利用试验,16S rDNA基因系统发育分析等结果将LW4菌株鉴定为Pseudomonas sp.。将LW4菌株与本实验室分离保存的另一株降解菌LW3菌株进行比较和研究,以期将生长和降解性能更好的菌株进行应用。LW3菌株的最适生长pH为7.0,最适生长温度为30℃,最适C/N为8：1；LW4菌株最适生长pH为7.0,最适生长温度为30℃,最适C/N为16：1。两株菌均可以在以氯嘧磺隆为唯一碳源或氮源的培养基中生长。接种量和通气量越大,菌株降解氯嘧磺隆的效果越好,添加葡萄糖和和蛋白胨能分别促进菌株LW3和LW4的降解。LW4菌株在低盐浓度(5-20 g·L-1NaCl)的时候降解率明显低于LW3菌株,在高盐浓度(25-50g·L-1NaCl)时降解率的下降却慢于LW3菌株,Mg2+对LW3菌株降解氯嘧磺隆有一定的促进作用,Ca2+, Mn2+, Cu2+则会强烈抑制LW3对氯嘧磺隆的降解,对LW4菌株的降解而言,A13+有促进作用而Zn2+, Mn2+, Cu2+则有抑制作用。两个菌株的氯嘧磺隆降解酶均为胞内酶,不受底物氯嘧磺隆的诱导,为组成型表达。LW3菌株降解酶的最适pH为7,最适温度为30℃,在pH6-7时最稳定,LW4菌株降解酶的最适pH为7,最适温度为30℃,pH6-8时最稳定。Mg2+能促进LW3菌株的酶活,而Zn2+、K+对LW3酶活有抑制作用；A13+能显著促进LW4菌株的酶活,Zn2+、K+则对其有抑制作用。通过对菌株LW3和LW4的生长及降解情况的比较,菌株LW3具有更好的降解性能,利用HPLC和LC-MS的手段检测了LW3菌株在以氯嘧磺隆为唯一氮源的液体培养基中降解氯嘧磺隆时产生的中间产物,对其结构进行了分析,并推测了LW3菌株降解氯嘧磺隆的途径,LW3菌株降解氯嘧磺隆时可能首先进行乙酯皂化,然后发生脲桥断裂,生成N-醛基糖精和2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶。采用了传统的分离和培养等技术,研究了49 d内不同浓度氯嘧磺隆对从未受到氯嘧磺隆污染的黄棕壤中的可培养微生物数量的影响及其动态变化过程,各浓度的氯嘧磺隆刚开始表现出对土壤细菌和真菌的抑制,14d后抑制作用解除,同时表现出一定的促进作用,28 d后,细菌和真菌的生长促进作用开始减弱,到49 d试验结束时基本恢复到对照水平；高浓度(20,50μg·kg-1干土)的氯嘧磺隆能严重抑制土壤放线菌的生长。各浓度氯嘧磺隆对土壤呼吸强度有一定的抑制作用,但影响不大,28 d时能基本恢复。氯嘧磺隆的使用能显著抑制土壤多酚氧化酶、蔗糖酶和脲酶活性,且氯嘧磺隆浓度越高,抑制作用越明显；土壤脱氢酶活性受到较明显的激活而酸性磷酸酶则有轻微的抑制；土壤过氧化氢酶活性在低浓度(5,10μg·kg干土)时受到激活,而在高浓度(20,50μg·kg干土)时则受到明显的抑制。研究了不同土壤中氯嘧磺隆对玉米的药害作用,氯嘧磺隆能对玉米产生比较严重的药害,在不同土壤中,其对玉米生长抑制作用的大小顺序是高沙土黄棕壤红壤。构建了具有荧光标记的LW3菌株,研究了LW3菌株对土壤氯嘧磺隆的降解,发现其降解作用主要发生在接种菌剂后的30 d以内,其降解率受到菌剂接种量、土壤温度、土壤pH和土壤含水量等因素的影响,在接种量1.0×107CFU·g-1干土,pH7,温度30℃条件下,菌剂对土壤中残留的氯嘧磺隆降解效果最好。适当的土壤含水量对菌株降解氯嘧磺隆很重要,在土壤含水量在15-40%之间时,土壤含水量越多,越利于氯嘧磺隆的降解,含水量过低(≤10%)和淹水条件都会显著降低LW3的降解能力。使用LW3菌剂浸种和直接在土壤中投加LW3菌剂均能在不同程度上缓解土壤中氯嘧磺隆对玉米生长的抑制作用。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X172
【图文】：

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图I-ILwa在LB平板上的照片

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第二部分实验部分第一章氯嚓磺隆降解菌LW4的分离鉴定和降解特性研究 2.3LW4菌株的基因组DNA的提取降解菌株I‘W4菌株的基因组DNA提取结果见图1一3，提取的基因组DNA用于PCR扩增。 2.4165rDNA的扩增以LW4菌株总DNA为模板，通过PCR的方法扩增细菌 165rDNA得到长约1419bP的扩增产物(图1一4)。

【参考文献】