河南华溪蟹金属硫蛋白的表达与功能分析及ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-07-03 07:57

【摘要】：环境污染,特别是水体污染是目前严重危害人类的危机之一,其中重金属污染更为突出。随着对环境重金属污染的危害、生物耐受重金属污染的细胞及分子机理、环境重金属污染的生物修复方面的深入研究发现,金属硫蛋白(Metallothionein, MT)在重金属解毒及环境污染监测和生物修复中具有极为重要的作用。MT是一类广泛存在于生物界,分子量较低(6～7 kDa),富含半胱氨酸,缺少芳香族氨基酸和组氨酸,且能与多种重金属结合的热稳定胞内蛋白质。大量研究已经证实,MT具有保持体内必需金属元素平衡和重金属解毒的双重机制,同时在清除自由基、抵抗氧化压力,以及参与激素和发育过程调节等方面都具有重要作用。河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)由海洋蟹类多元进化而来,隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)中的一个特殊分支,广泛存在于我国山西省和河南省。作为生活于水体基底层的生物,河南华溪蟹直接面对沉积在水体的金属离子,其MT的作用更为凸显。本课题组在前期研究工作中,系统研究了河南华溪蟹主要组织MT表达以及与重金属蓄积的关系,并完成了镉诱导河南华溪蟹MT cDNA全长序列的克隆。为深入研究河南华溪蟹MT的理化特性和生物学功能,探究其在重金属胁迫中的解毒机制,分析MT在重金属污染生物修复和重金属环境污染监控及保护中应用的可能性,本学位论文完成了以下四部分的研究工作。1、河南华溪蟹金属硫蛋白的表达及其抗重金属胁迫能力研究利用SUMO融合表达系统重组表达了河南华溪蟹MT,经Ni离子金属螯合柱分离纯化后,对其金属结合及清除自由基能力进行了检测；利用纯化的融合蛋白SUMO-MT免疫BALB/c、鼠制备抗血清,间接ELISA检测该抗血清的效价,Western blot和免疫组化染色检测其特异性；采用定点突变技术对MT的一级结构进行改造,构建了两种突变体SUMO-MTt1 (N2C)和SUMO-MTt2 (S36C),分别测定了MT及其突变体对Cu、Cd、Zn三种金属的抗性及蓄积能力。结果表明,河南华溪蟹MT以可溶形式获得表达,经金属螯合层析纯化后分析其仍具有金属结合特性和清除羟自由基的生物学功能；免疫BALB/c小鼠后获得特异性的抗MT抗血清,该抗血清具有较高的效价和良好的特异性,可识别组织MT,用于免疫组化分析；成功构建了SUMO-MTtl (N2C)和SUMO-MTt2 (S36C)两种突变体,且较空菌体,三种转MT或突变体工程菌对Zn2+、Cd2+和Cu2+三种重金属的抗性及蓄积能力均有显著提高,金属离子在重组工程菌体内的积累和抗性基本呈现如下顺序：SUMO-MTt1 SUMO-MTt2 SUMO-MT;针对同一价态、不同类型的金属离子,三种工程菌对Cd2+的积累最大,而Zn2+和Cu2+的吸收能力相近。2、河南华溪蟹金属硫蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以重组融合蛋白SUMO-MT为免疫抗原、切割融合标签后MT为检测抗原,利用杂交瘤技术建立抗河南华溪蟹MTmAb杂交瘤细胞株。采用间接ELISA测定mAb腹水效价,Western blot法、Dot-ELISA分析mAb的特异性,叠加ELISA法鉴定了两种单克隆抗体的抗原结合表位。结果显示,成功建立了2株稳定分泌抗MT蛋白的单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株,分别命名为mAb-MT2和mAb-MT3,均属于IgG1亚类。腹水效价分别为1：5×105、1：1×106,Western blot和Dot-ELISA结果证实两株mAb均能特异性识别重组MT和内源性组织MT,叠加ELISA法测定两种mAb具有同一的抗原识别位点。高特异性河南华溪蟹MTmAb的制备、鉴定及其免疫学特性分析,为深入研究MT的生物学功能以及建立快速、敏感的新型免疫学检测方法奠定了基础。3、河南华溪蟹金属硫蛋白的分泌表达与免疫亲和纯化及金属结合能力采用基因重组技术,将河南华溪MT基因亚克隆至phoA分泌型原核表达载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3),通过低磷酸盐诱导重组非融合型MT表达；利用单克隆抗体]mAb-MT2免疫亲和层析分离纯化重组MT蛋白,紫外光谱扫描分析、SDS-PAGE及Western blot鉴定；测定重组MT的自由基清除能力,分析其体内金属亲和特性；MT经体外重构后,紫外扫描不同金属/MT复合物,分析其体外金属结合偏好。结果表明,利用phoA分泌表达系统,成功实现了非融合MT的重组可溶表达,紫外光谱扫描和Western blot均证实表达产物的正确性,SDS-PAGE分析其纯度较高,主要以单体和二聚体的形式存在,其分子量分别约为7.5 kD和15 kD；非融合MT具有与SUMO-MT一致的自由基清除能力,在Zn、Cu、Cd三种不同金属离子胁迫下,MT蛋白表现出不同的金属亲和力顺序：ZnCuCd;经体外重构后,紫外光谱扫描结果显示均形成单一金属/MT复合物,进一步分析显示,河南华溪蟹MT与Zn、Cu、Cd三种不同金属离子几乎具有一致的金属结合能力,证实其属于非金属结合特异性MT而在体内具有多种生理功能。本研究利用phoA分泌表达系统,实现了河南华溪蟹非融合型MT的可溶表达,并利用MT单克隆抗体建立了高效、简便的免疫亲和纯化方法,分析了MT体内、体外金属结合特性,为深入研究河南华溪蟹MT在体内的生理功能奠定了理论基础。4、河南华溪蟹金属硫蛋白酶联免疫吸附检测方法的建立选择具有良好免疫原性的河南华溪蟹重组SUMO-MT蛋白作为免疫抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA和Western blot检测其特异性；以重组非融合河南华溪蟹MT作为标准蛋白,利用河南华溪蟹MT单克隆抗体mAb-MT3作为捕获抗体,以纯化的兔多克隆抗体作为检测抗体,通过棋盘滴定法确定最佳实验条件,建立了河南华溪蟹MT双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,捕获抗体最佳稀释倍数为1：12800,检测抗体最佳稀释倍数为1：6400；标准曲线方程为y=0.0035x+0.0068(R2=0.9981),其中x为MT蛋白浓度、y为OD450值,工作范围为40-800 ng/mL;该方法的检测灵敏度为20.0 ng/mL,批内和批间差分别为4.22%和4.09%,具有良好的重复性。准确、特异、灵敏的ELISA检测方法的建立,为河南华溪蟹MT的深入研究及其在环境监测中的应用奠定了基础。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X835;X503.22

【参考文献】