PBDEs降解菌Lysinibacillus varians GY32的鉴定与丝状—杆状细胞周期及其分子机理

发布时间：2020-07-12 01:47

【摘要】：细菌细胞形态主要取决于细胞生长、细胞分裂和细胞周期。细胞生长主要是细胞结构组分的生物合成和核酸复制。细胞分裂包括细胞壁和细胞膜的重建与分隔,以及遗传物质的分离。细胞周期则涉及到基因表达的时空特异性、蛋白定位和蛋白形式的调控。典型模式细菌Bacillus subtilis和Escherichia coli形态形成的分子机理已经成为细胞学研究的热点。但是,对于具有丰富多样性的环境微生物的细胞形态形成规律、分子机制以及对应的生理功能,仍有待研究。本文研究一株从多溴联苯醚污染的河流底泥中富集分离到的、具有独特丝状-杆状细胞形态变化周期的芽胞细菌(编号GY32),系统开展了该菌对十溴联苯醚(BDE209)的生物转化作用、分类鉴定、细胞周期模型构建、基因组学、比较基因组学以及特殊细胞形态变化的转录组学等研究,主要得出了如下结果:菌株GY32的生物修复潜力研究证实其具有吸附和转化十溴联苯醚(BDE209)的能力。菌株GY32活细胞和死菌体的吸附能力测定证实两种情况吸附BDE209的量分别为18.43和13.05μg L-1。比较好氧、厌氧以及兼性厌氧条件下一个月内该菌株对BDE209的转化率,结果显示:在初始浓度为0.6μmol L-1时,该菌在厌氧和兼性厌氧条件下的BDE209去除率分别为31.7%和56.9%,而好氧体系中未见明显的BDE209减量。本研究为进一步研究开发兼性厌氧条件下菌株GY32对BDE209污染修复的应用潜能提供了参考。菌株GY32的分类学研究确定其为赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)的新种。形态学、生理生化指标、化学指标以及分子鉴定等多相分类研究结果显示,菌株GY32具有与同属菌种相似的一般生理生化特征,如生长条件、V-P试验、细胞壁氨基酸类型、脂肪酸组成、醌型等,但是具有不同于属内其他菌种的特殊细胞形态变化周期、碳源利用谱、硝酸盐还原阳性及氧化酶测定阴性等特征,与属内近缘菌种的(G+C)mol%差异约为5%,DNA-DNA杂交率为52.1%。上述差异特征显示该菌为Lysinibacillus属的一个新种,定名为变形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus varians)。菌株GY32分类地位的确定不仅丰富了Lysinibacillus属的组成,还为进一步开展此类环境微生物的其他研究,如潜在的生理功能和特定表型的分子基础提供了参考。基于菌株GY32的形态学研究确定了丝状-杆状细胞形态的变化过程并构建了此类菌株的细胞周期模型。本研究通过纯芽胞收集、调节培养物稀释倍数、摸索芽胞萌发条件,结合单个细胞发育实时在线观察技术,记录了从芽胞膨胀萌发到细胞长成丝状再到分裂成杆状直至再次形成芽胞的完整过程。芽胞在30℃条件下孵育2 h后,从芽胞萌发到再次形成芽胞的约33 h的细胞周期大致分为七步:(i)芽胞历时约4.5 h膨大、出芽;(ii)芽在约2.0 h内生长为杆状细胞(10μm)并脱离芽胞外壳;(iii)杆状细胞在约1.5 h内,不发生细胞分裂而是快速生长成丝状细胞(~466.1μm);(iv)丝状细胞开始不对称二分裂。母细胞与子细胞同时继续生长,体系中细胞形态维持在大于10μm的丝状,这个过程约3.0 h;(v)之后的约5.0 h内,丝状细胞生长到约原始长度的2倍时,就不对称地二分裂,体系中丝状和少量新分裂出的杆状细胞共存。部分从芽胞萌发开始一直未分裂的丝状细胞开始自溶;(vi)杆状细胞比例越来越高,约12 h之后以长度为5.0~10.0μm的杆状细胞为主;(vii)约5.0 h后,体系内全为杆状细胞,并且开始形成内生芽胞。菌株GY32代表了不同于常规杆菌和球菌的新型的细胞形态变化周期,相应的模型为进一步开展这类细菌的细胞形态形成分子机理奠定了基础。菌株GY32的基因组学研究确定了与该菌细胞形态形成相关的基因。通过全基因组序列测定,发现菌株GY32基因组由一个环状染色体构成。基因注释结果显示该基因组中存在的双组份系统基因、转录调节因子及Sigma因子等起调节作用的基因是特定表型表达调控的基础;基因组中存在的细胞分裂相关基因与已知基因的同源性很高,但是其中同源基因的拷贝数有差异;基因组中具有不同于近缘菌种的细胞隔膜合成基因;移动遗传元件为该基因组引入了新的细胞壁合成基因。这些直接与细胞分裂和细胞调控相关的基因是Lysinibacillus varians GY32形态变化的遗传基础。比较基因组和转录组学分析分别提供了GY32特有的细胞形态形成相关基因以及丝状向杆状细胞形态转变时相关基因的转录水平存在显著差异的证据。菌株GY32中1300个与参比基因组同源性低的基因分别与转录、信号传递机制、细胞壁/细胞膜/细胞包被形成、碳水化合物转运和代谢、氨基酸转运和代谢等方面的功能相关。其中与细胞分裂位点选择相关的fts L、div IC、ded D、与分裂体锚定细胞膜相关的sep F、与染色体复制和分离相关的par A、par B、与细胞壁和细胞膜合成相关的cwl K、pbp2B、maf B-like、fts E、fts X在菌株GY32的丝状和杆状两种细胞中的转录水平具有显著差异,上述基因表达上调是细胞分裂加剧的分子基础。而fts Z转录水平未见显著差异则表明在两种细胞形态下分裂体的关键骨架(Fts Z多聚体)组装未受影响。核酸染色和转录组分析结果相结合显示丝状细胞形态中分裂位点能顺利定位,分裂体骨架也可以正常组装,但是由于sep F表达量低,Fts Z多聚体未能锚定到细胞膜,不能实现进一步细胞分裂。本论文的相关研究发现并确立了一个具有特殊丝状-杆状细胞形态变化周期的赖氨酸芽胞杆菌新种,构建了此类菌的细胞周期模型,明确了该菌基因组中细胞形态形成相关基因的组成和特异的目标基因的表达情况。本研究的结果初步证实在Lysinibacillus varians GY32从芽胞萌发至形成丝状过程中,由于分裂体骨架未能锚定到细胞膜并提供细胞内缢的力,导致细胞不分裂而是持续伸长。而起锚定作用的sep F的表达上调,配合相应细胞隔膜形成基因的上调表达,直接引起了细胞形态由丝状向杆状变化。显然,确定此类菌细胞形态形成的分子机制细节还有很长的路要走,但现有研究提供了初步的实验证据,为进一步开展细胞分裂活动的抑制和解抑制、细胞周期的调控、以及开发菌株GY32对BDE209的降解功能奠定了基础。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X172

【参考文献】