铜绿假单胞菌SJTD-1降解烷烃的分子机制研究

发布时间：2020-07-12 18:55

【摘要】：石油污染对生态环境的危害日益严重。物理化学方法治理石油污染虽然有效,但是成本高、甚至有次生污染的风险。微生物修复技术可有效去除石油污染,具有代谢终产物无毒性,操作简单,价格低廉等优势,但存在降解速度慢、受环境因素如温度、pH值等影响大、修复菌株潜在的生态危害等局限性。因此,筛选或者人工构建降解能力强、环境适应性优越、可控且无环境生态危害的工程菌株将极大地促进微生物生态修复技术的应用。筛选石油降解菌株、确定石油降解的分子机制研究石油降解的分子机制,进而通过基因改造强化石油降解能力和环境适应能力已成为当今生物修复石油污染研究的重要研究方向。本文从大庆油田污染土壤中分离获得一株可高效利用石油烃类物质的菌株SJTD-1,从直链烷烃降解效能分析、全基因组序列比对与蛋白组学分析、烷烃氧化酶的鉴定及其表达调控机制这几方面进行系统研究。以不同长度直链烷烃为单一碳源培养菌株SJTD-1,生长曲线显示其在C16-C20烷烃中生长最佳,并能在高达2 g/L的正十六烷培养基中生长。气相检测结果显示,该菌株在36小时内可将500 mg/L的正十四烷,正十六烷与正十八烷全部分解,七天内对2 g/L烷烃的分解率超过95%。以上结果说明菌株SJTD-1能高效降解直链烷烃。经16S rDNA序列比对及系统发育分析表明菌株SJTD-1属于铜绿假单胞菌,故将其命名为铜绿假单胞菌SJTD-1。利用Roche 454 FLX+及Illumina Miseq测序平台对SJTD-1全基因组进行测序。基因组全长6,074,058 bp,预测编码蛋白质5560个。全基因组序列比对分析显示,菌株SJTD-1中含有至少5个烷烃氧化酶同源蛋白,其编码基因为两个烷烃羟化酶基因alkB1(SJTD-1_4712),alkB2(SJTD-1_3623),两个细胞色素P450基因(SJTD-1_5482和SJTD-1_4609),和一个almA-like黄素单加氧酶基因(SJTD-1_3206)。利用iTRAQ-based蛋白质组学方法比较以葡萄糖或正十八烷烃为单一碳源时SJTD-1全蛋白的表达差异。结果显示共有476个差异蛋白(占据基因组编码蛋白总量的8.4%),涵盖摄取、代谢到能量转化烷烃底物的完整过程,以及分泌、环境压力、调控等细胞进程。特别的,在表达上调蛋白中发现了与乙醛酸循环、趋化性、VI型分泌系统相关的一系列蛋白,提示当烷烃存在时菌体这些生理活动增强,为探索烷烃降解途径、改造应用型工程菌株提供了新的研究视角。另外,基因预测的AlkB2(SJTD-1_3623编码)的表达量上调4.05倍,说明AlkB2的表达受正十八烷烃强烈诱导,提示该蛋白在长链烷烃代谢中的重要作用。同时发现另一个与AlmA-like黄素单加氧酶有一定同源性的蛋白(SJTD-1_3636编码)表达上调2.35倍,这是首次在假单胞菌中发现AlmA-like家族蛋白受长链烷烃诱导,为研究长链烷烃代谢机制提供了重要的数据依据。通过基因敲除及RT-qPCR实验方法对预测的5个烷烃氧化酶进行功能鉴定。RT-qPCR结果显示,alkB1和alkB2均受到中短链烷烃(n?16)不同程度诱导,且alkB2在长链烷烃(n?18)培养基中被诱导。将野生型菌株与各敲除菌生长及降解效率对比分析得知,alkB1或alkB2缺失菌株与野生型比烷烃降解谱出现漂移,但生长差异不十分明显;而双敲除菌在中短链烷烃培养基中几乎不生长,提示中短链烷烃的氧化主要由两个AlkB蛋白负责,且两者在底物谱上存在重叠。由SJTD-1_5482和SJTD-1_4609编码的P450蛋白和SJTD-1_3206编码的AlmA-like蛋白分别受到短链和长链烷烃一定程度诱导,但是生长降解实验显示它们并非主要的烷烃氧化酶。以上表明,除了AlkB2外,SJTD-1菌中仍存在未知的烷烃氧化酶参与长链烷烃的降解过程。为阐明烷烃诱导烷烃羟化酶表达的分子机制,以alkB2基因上游序列为诱饵,亲和纯化DNA结合蛋白,显示Gnt R(SJTD-1_3624)与该DNA亲和性很高。凝胶阻滞实验证实该GntR蛋白与alkB1和alkB2上游序列发生特异性结合,且与后者的结合十分紧密,而直链烷烃可抑制蛋白与DNA的结合。DNase I足迹实验确定了GntR的结合位点位于alkB2启动子上游30 bp处类回文结构序列5‘-att-GT-cag-AC-aat-3‘。基因敲除与生长降解分析进一步证实该GntR蛋白以负调控模式直接调控alkB2的转录。据我们所知,至今尚无文献证实转录因子GntR直接参与烷烃降解调控的作用。综上所述,本论文对这株石油高效降解菌SJTD-1的降解性能、降解关键基因与调控分子机制进行了深入且详尽的研究,为其他烷烃降解菌株的机制研究与分子改造奠定了基础,必将推进相关机制研究与实际应用的进程。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X172

【参考文献】