极端环境砷氧化微生物多样性、活性特征及其对砷释放的影响

发布时间：2020-07-25 22:24

【摘要】：地下深部、酸性矿坑排水、热泉、以及高盐等极端环境往往栖息着很多微生物,极端环境微生物是地球生物圈的重要组成部分。这些极端环境有的含有高浓度砷;但是,至目前为止,对这些极端环境高砷沉积物中广泛存在的砷氧化菌还知之甚少,对这些微生物的多样性与活性特征、及其介导的砷的生物地球化学过程还未见报道。本论文以典型高砷地下水区域地下深部高砷沉积物、雄黄尾矿酸性矿坑排水高砷土壤、热泉高砷沉积物等三个代表性的极端环境砷氧化微生物为研究对象,较系统地分析了微生物群落和砷氧化酶基因的多样性特征、砷氧化微生物的功能、以及砷氧化微生物对矿物砷溶解和释放的影响,揭示了极端环境条件下砷氧化微生物在砷的生物地球化学循环中所起的作用、及其对高砷地下水形成的影响,为砷污染环境的微生物修复提供依据。地下深部高砷沉积物砷氧化微生物多样性、活性特征及其对砷释放的影响。地球化学分析结果表明,地下深部高砷沉积物含高浓度的总砷(6.74-27.90 mg/kg)、TOC(0.27-8.37 g/kg),相对较高浓度的SO_4~(2-)(14.53-863.87 mg/kg)、NH_4~+(3.12-52.77g/kg)、Cl~-(3.88-511.76 mg/kg)、Fe(12.13-62.50 g/kg),以及相对较低浓度的NO_3~-(0.23-3.03 mg/kg)、Ca(6.80-32.34 g/kg)、Mg(2.33-12.22 g/kg);采用Illumina Miseq高通量测序技术,分析了样品的微生物群落结构,发现高砷沉积物样品含有的微生物隶属于31个门,其中占优势的微生物有Firmicutes(63.20%)、Proteobacteria(24.77%)和Actinobacteria(6.88%);微生物群落结构与环境因子的相关性分析表明,对微生物群落结构影响较大的环境因子有Cu(R~2=0.9564,P=0.075)、Sb(R~2=0.9088,P=0.018)、Al(R~2=0.8969,P=0.033)、TON(R~2=0.7358,P=0.017)、K(R~2=0.7355,P=0.023)、以及Fe(R~2=0.6314,P=0.078);另外,Fe与Al、Cu、Sb、K、TON呈正相关,与TOC成负相关;TOC对沉积物深度为1 m、114 m、223 m和200 m样品的微生物群落结构影响较大,对深度为30 m、65 m、95 m、175 m和145 m的样品微生物群落结构影响较小。高砷沉积物样品微生物催化砷氧化的microcosm实验表明,所有9个高砷沉积物样品中的微生物既能利用有机碳源、又能利用无机碳源;当反应体系添加0.2%酵母提取物或10.0 mM NaHCO_3为外加碳源时,样品微生物能分别在48-95小时和72-288小时内将1.0 mM As(III)完全氧化。地下深部高砷沉积物样品微生物群落砷氧化酶催化亚基AioA的基因序列的生物信息学分析表明,共获得了98条新的AioA蛋白序列,包括由11个新的AioA组成的砷氧化酶新家族,进化位置介于β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria之间;由10个新的AioA组成的3个砷氧化酶新亚家族,三个新亚家族分别属于β-Proteobacteria、β-Proteobacteria、α-Proteobacteria;以及其余76个新的AioA蛋白,分别属于ε-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、β-Proteobacteria、α-Proteobacteria AioA。这些aioA基因序列与已知的细菌界和古菌界微生物的同源性为34-99%。以上结果表明,地下深部高砷沉积物中含有的砷氧化微生物均为新的未报道的砷氧化微生物。地下深部高砷沉积物微生物群落砷释放结果表明,高砷沉积物中的微生物在有氧条件下,明显促进了沉积物中的不溶性砷的溶解和释放;微生物作用28天后,114 m样品释放的砷浓度最高,为10.78μM,其次是65 m样品,释放的砷浓度为4.69μM,其它样品释放的砷浓度从高到低依次是:95 m(3.48μM)、200 m(3.19μM)、135 m(2.89μM)、175 m(2.01)、223 m(1.60μM)、30 m(1.41μM)、和1 m(0.52μM)。微生物催化的砷释放浓度随着时间的变化,或增高,或降低,表明反应体系中发生了微生物介导的砷溶解和砷吸附等过程。酸性矿坑排水高砷沉积物砷氧化微生物多样性、活性特征及其对砷释放的影响。地球化学结果表明,与其它已报道的酸性沉积物相比,酸性矿坑排水高砷沉积物含较高浓度的总砷(973.54-13387 mg/kg),相对较低的TOC(4.3-5.1 g/kg),相对较高的SO_4~(2-)(1240-60680 mg/kg)。酸性矿坑排水高砷沉积物微生物群落有细菌24个门,占优势的微生物为Firmicutes(86.29%)、Proteobacteria(11.89%)。酸性矿坑排水高砷沉积物中微生物群落催化砷氧化的microcosm结果表明,3个高砷沉积物样品既能利用有机碳源又能利用无机碳源进行氧化。当以0.2%酵母提取物或10mM NaHCO_3为外加碳源时,沉积物能分别在48-72小时、48小时将外源1 mM As(III)完全氧化。酸性矿坑排水高砷沉积物中微生物群落的砷氧化酶催化亚基AioA的基因序列的生物信息学分析表明,共获得了31条新的AioA酶,包括由1个新的AioA组成的砷氧化酶新家族,进化位置介于α-Proteobacteria和Archeae之间;由2个新的AioA组成的2个砷氧化酶新亚家族,两个新亚家族分别属于β-Proteobacteria和α-Proteobacteria;以及其余29个属于β-Proteobacteria、α-Proteobacteria的新成员。这些aioA基因序列与已知的细菌界和古菌界微生物的同源性为42-95%。酸性矿坑排水高砷沉积物在好氧状态下微生物群落砷释放结果表明,高砷沉积物中的微生物在有氧条件下,明显促进了沉积物中的不溶性砷的溶解和释放;微生物作用28天后,沉积物T4释放的砷浓度最高,达152.22μM,其次为沉积物T1B(118.20μM)、T4(158.08μM)。热泉高砷沉积物砷氧化微生物多样性、活性特征及其对砷释放的影响。地球化学结果表明,热泉高砷沉积物其它已报道的热泉沉积物相比,含较高浓度的总砷(8.64 mg/kg),相对较高的TOC(34 g/kg)。热泉高砷沉积物微生物群落结构有7个不同的细菌门类。其中,最丰富的是Proteobacteria(54.46%)、Firmicutes(31.68%)、Bacteroidetes(4.46%)、Chloroflexi(3.96%)。热泉高砷沉积物微生物群落催化砷氧化的microcosm结果表明,热泉高砷沉积物样品既能利用有机碳源又能利用无机碳源进行氧化。当以0.2%酵母提取物、10 mM NaHCO_3、10.0 mM葡萄糖、10.0 mM乳酸为外加碳源时,热泉高砷沉积物能分别在216小时、264小时、120小时、120小时内将外源1 mM As(III)完全氧化。但是热泉沉积物微生物群落并非能利用所有碳源,当添加10.0 mM乙酸作为唯一碳源时,其氧化效率与不添加沉积物的对照组一致。热泉高砷沉积物中微生物群落的砷氧化酶催化亚基AioA基因序列的生物信息学分析表明,热泉高砷沉积物微生物群落共获得了20条新的AioA蛋白,包括由1个新的AioA组成的砷氧化酶新家族,进化位置介于β-Proteobacteria和Archeae之间;由1个新的AioA组成的1个β-Proteobacteria砷氧化酶新亚家族;以及其余18个属于β-Proteobacteria、α-Proteobacteria的新成员。这些aioA基因序列与已知的细菌界和古菌界微生物的同源性为44-93%。此外,分离到1株嗜热砷氧化微生物GHS311。GHS311在30℃或65℃下完全不生长;在45℃下,菌株GHS311才得到最适生长。编码嗜热菌株GHS311亚砷酸盐氧化酶大催化亚基AioA的基因与其它已知可培养单株AioA序列同源性为84.7%-57.6%,有趣的是,这6个单株均为非嗜热单株。热泉高砷沉积物在好氧状态下微生物群落砷释放结果表明,高砷沉积物中的微生物在有氧条件下,明显促进了沉积物中的不溶性砷的溶解和释放;微生物作用28天后,添加10 mM NaHCO_3的实验组砷最高释放浓度为5.79μM,添加0.2%酵母提取物实验组最高砷释放浓度为3.09μM。此外,筛选到了地下深部23株可培养砷氧化微生物,分别来自α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes。砷氧化活性检测后,发现有9株菌表现出了较强的砷氧化能力,7株为自养型,2株为异养型。化能自养砷氧化微生物和异养型砷氧化微生物能分别在14-60小时、34-60小时之内将1 mM As(III)完全氧化。最终成功扩增、克隆了7株菌的砷氧化酶,其砷氧化酶分别属于α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria的AioA家族,最大同源性为79%-99%。有两株微生物(Pseudorhodoferax sp.N105-12和Shinella sp.N114-3)的aioA基因发生了水平基因转移。砷氧化微生物对含砷矿物(毒砂)砷释放的结果表明,有氧状态下,砷氧化微生物可促进或抑制毒砂的砷释放,但不同微生物促进/抑制砷释放程度完全不同。微生物作用28天后,菌株N105-5和N105-12对毒砂砷释放的最高抑制浓度分别为13.8μM、12.4μM;菌株N105-16、N114-3、N125-8、N125-10在一定时间内,对毒砂的促进浓度分别为9.3μM、5.9μM、4.1μM、6.5μM。最后,比较分析了这三种极端环境高砷沉积物砷氧化微生物多样性、活性特征及其对砷释放的影响。结果表明,酸性矿坑排水沉积物总砷含量(973.54-13387mg/kg)最高,热泉沉积物TOC含量(34 g/kg)最高。微生物群落结构多样性表明地下深部高砷沉积物所含门类(31个)最多,其次为酸性矿坑排水高砷沉积物(24个)、热泉高砷沉积物(7个)。微生物群落催化砷氧化能力由大至小依次为酸性矿坑排水高砷沉积物、地下深部高砷沉积物、热泉高砷沉积物。功能酶基因aioA在相应微生物群落中多样性由高至低依次为地下深部高砷沉积物、酸性矿坑排水高砷沉积物和热泉高砷沉积物。沉积物样品微生物群落砷释放最高浓度由高至低依次为酸性矿坑排水高砷沉积物、地下深部高砷沉积物和热泉高砷沉积物。
【学位授予单位】：中国地质大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X172
【图文】：

全球分布,地热,地下水,环境

经铬砷酸铜处理的木材的加工；⑦在部分东欧地区的前军事基地里，化学武器乙烯基二氯胂、二苯氯胂、苯氯乙酮的生产和储存而导致的严重污染; ⑧农业砷试剂的大量使用，如有机砷化合物洛克沙胂(4 -羟基-3 -硝基苯基胂酸)；⑨过程等。.1.2 砷的分布及含量伴随着天然过程和人类活动两种方式，砷对环境造成了严重的污染。陆地上的丰度平均为 1.5-3 mg/kg。(1) 地下水是最多，也是最主要的易被人类接触到砷的一种方式。目前，全很有地方受高砷地下水的污染(图 1.1)[15]。被研究相对深入的高砷地下水区域]有孟加拉、孟加拉邦、中国(台湾、内蒙古、山西)、阿根廷(Chaco-Pampean 平原利北部、泰国(Ron Phibun)等地，其地下水砷浓度分别为 0.5-2500 μg/L、1-3g/L、10-1820 μg/L、1-2400 ug/L、1-3050 μg/L、1-5300 μg/L、100-1000 μg/L、000 ug/L 等。此外，高砷沉积物中也发现了砷的存在，主要来源矿物砷的释放

原核微生物,代谢途径,转运系统

图 1.2 原核微生物砷代谢途径[71]微生物对砷的摄取、沉淀及排出酸盐与磷酸盐结构类似，主要通过磷酸盐转运系统[71]进入革兰氏阴性细磷酸盐转运系统介导了此过程：结构型的 Pit 和诱导性的 Pst。一般主要转运系统进入细胞，只有在环境中磷酸盐水平较低时，才会大量通过 Pst进入细胞[72]。砷酸盐与甘油结构类似，在 pH 小于 9.3 时，以不带电荷的 As(OH)3形式此大部分亚砷酸盐通过水-甘油跨膜转运通道进入细胞[73-75]。原核生物大scherichiacoli)GlpF 的突变体保留了对 As(III)的敏感性，因此，有 1-2 个s(III)摄取系统，比如 ABC 转运系统，有助于 As(III)的摄取。砷可能对细胞造成毒性前，微生物通过胞外沉淀(Extracellularprecipitatiohelation)、细胞内隔离(Intracellularsequestration)、外排系统(Activeextrushe cell)来降低砷对细胞的伤害[76]。

微生物催化,生物地球化学循环

正因为有了微生物的关键作用，才使得砷的地球化学循环成为可能[微生物催化的砷的生物地球化学循环过程如下(图 1.3)：①各种具备生物厌氧砷还原的微生物将 As(V)还原成 As(III)[137-138]。其中厌氧砷还原微生物了富 As(V)沉积物中 As(V)向 As(III)的转化，由于 As(III)易迁移的特性，同地下水和/或土壤造成了污染[139]。②As(III)反过来，又被亚砷酸盐氧化微生成 As(V)。As(III)的氧化可导致海洋沉积物/淡水沉积物中的矿物对 As(V)的吸附[140]。As(III)同时也可被依赖亚砷酸盐的不产氧光合作用氧化[141]。③无可以转化成甲基砷进行解毒。甲基化的砷以挥发性的甲基胂形式存在，主A(III)，以及少量 MMA(III)和 DMA(III)[142]。④甲基砷也可以去甲基化成无-145]，与③形成双向循环，目前在很多环境中都有发现[146-158]。比如人为用剂和杀虫剂等[159-160]的有机砷化合物如 MAs(V)和洛克沙砷，可在环境中微用下去甲基化成无机砷。⑤海水中砷的主要形式为 As(V)，它可被藻类转化[161]。⑥在很多生物体中都发现了砷累积现象。如蕨类植物在其地面以上组超富集砷[162-163]，水稻植物不仅可以不仅可以吸收无机砷而且可以将其甲基终在谷粒中累积[164]，海洋动物可以累积砷糖及砷甜菜碱等[165]。

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