链霉素药渣危害因子确证及其诱导细菌耐药机制研究
发布时间：2020-08-06 13:11
【摘要】：链霉素药渣是生物发酵生产链霉素过程中产生的工业废弃物,其含有一定浓度的粗蛋白和未被完全提取的链霉素,并且含有危害尚不明确的次级代谢产物,若将其饲喂动物存在食品安全隐患和诱导细菌耐药性风险。目前,国内外尚未开展链霉素药渣危害因子分析和诱导细菌耐药性的风险评估,而且尚无饲料中链霉素药渣确证分析方法。为了有助于实现有效的“事后监管”和充分的“事前预警”,本研究开展了链霉素药渣危害因子识别、饲料中链霉素药渣确证分析方法开发、危害因子诱导细菌耐药性风险分析及诱导细菌产生耐药的机制研究。具体研究内容和结果如下:1.链霉素药渣危害因子识别。将链霉素及其生物合成中间产物(共25种)作为危害因子靶向筛查范围,采用3种溶剂(高水相、高有机相、低pH)提取药渣中代谢物,2种色谱(反向、亲水)模式保留后分离,正、负电离(ESI±)模式电离,高分辨质谱在m/z:50-1200Da范围内检测代谢物组,发现并确认药渣中含有链霉胍和链霉素2种化合物。通过危害分析,发现链霉胍和链霉素存在动物食品蓄积毒性和诱导细菌耐药风险。因此,将其确定为链霉素药渣危害因子。2.将链霉胍、链霉素作为链霉素药渣特征标志物,建立了饲料中链霉素药渣确证分析方法。该方法以20%TCA溶液为提取溶剂,采用Na_2EDTA消除基质中金属离子干扰,通过弱阳离子交换固相萃取(WCX)方式净化、富集目标化合物,利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)正离子(ESI+)电离、多反应监测(MRM)模式检测2种特征标志物。方法准确性(链霉素:71% 78%,链霉胍:75% 84%)、精密度(5.4% 9.6%)、线性范围(50 1000μg/kg范围内R~2≥0.99)、LODs(20μg/kg)、LOQs(50μg/kg)等性能指标能够满足饲料中链霉素药渣确证分析要求。3.链霉素药渣危害因子诱导细菌耐药性风险分析。以大肠杆菌(E.Coli)、沙门氏菌(Salmonella)为受试菌,链霉胍、链霉素为诱导因子,开展了体外诱导耐药性风险分析。结果表明,链霉素能够诱导2种受试菌产生耐药性;链霉胍不能诱导2种受试菌产生链霉素耐药性,但是与链霉素同时存在条件下对E.Coli具有协同诱导耐药的作用。该结果从体外实验的角度表明链霉素药渣危害因子存在诱导细菌产生耐药性的风险,并且大于相同浓度链霉素的诱导耐药风险。4.采用非靶向代谢组学方法研究链霉素、链霉胍诱导E.Coli耐药机制。建立了E.Coli代谢组学样品前处理方法,即低温生理盐水q 灭,冷冻研磨-超声裂解细胞、冷甲醇-水(50/50,v/v)提取代谢物组。采用该方法对链霉素耐药E.Coli进行样品前处理,通过UPLC-QTOF对代谢物进行分离和测定,经PCA、OPLS-DA分析以及Chemspider等在线数据库比对方式筛选、鉴定出不同诱导方式诱导获得的耐药菌株与敏感菌株差异代谢物22种。经过KEGG代谢通路分析和MetaboAnalyst代谢通路拓扑分析,发现谷胱甘肽代谢、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解、丙酮酸代谢、丁酸代谢、脂肪酸代谢、丙酸酯代谢、泛酸和辅酶A生物合成、甘油磷脂代谢途径直接或间接介导E.Coli链霉素耐药,甘油磷脂代谢与链霉胍协同诱导耐药作用相关。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X787
【图文】：
图 1-1 氨基糖苷类抗生素的化学分类Fig. 1-1 Chemical classification of aminoglycosidesIshii 等(Ishii et al., 2008)应用弱阳离子交换 SPE（weak cation-exchange carboxypropyl SPEcartridge）净化了组织和内脏中多种 AGs，Almeida 等(Almeida et al., 2012)应用同样的 SPE 模式（BakerBond SPE Wide Pore CBX 和）处理肾脏样品中多种 AGs，Gremilogianni 等(Gremilogianniet al., 2010)应用弱阳离子交换 SPE（DSC-WCX cartridge Supelco）选择性吸附牛奶中链霉素和双氢链霉素， Bohm 等(Bohm et al., 2012)应用聚合物材料 SPE（Bond Elute Plexa cartridge ,Agilent）测定了蜂蜜中链霉素和双氢链霉素，Bohm(Bohm et al., 2012)和 Gbylik 等(Gbylik et al., 2013)利用反向萃取模式 SPE（Waters Oasis HLB SPE）开展了苹果中链霉素和鱼肉中多种 AGs 的测定。此外，一些研究者应用基质固相分散（MSPD）和分子印迹（MIP）(Ji et al., 2013)开展了 AGs 的前处理研究。由于 AGs 结构中缺少发色基团并具有强亲水性，在应用反相色谱（RPLC）分析时，为了改善可测定性和分离效果，常在柱前或柱后进行衍生化处理(Serrano and Silva, 2006)。离子对色谱（IPLC）和亲水色谱（HILIC）能够解决 AGs 色谱难保留的问题。由于 HILIC 流动相中使用缓冲盐数量少或多为挥发性缓冲盐，因此相对于 IPLC 更适合与质谱（MS）联用。毛细管电泳（CE）也适合与 MS 联用。使用柱前延生化将发色基团连接到 AGs 上能够改善其色谱保留特性，从而能
图 1-2 氨基糖苷类抗生素耐药机制示意图Fig. 1-2 Schematic overview of mechanisms of resistance toAGs突变修饰酶改变抗生素作用位点（核糖体），使药物难以与位点蛋白质翻译都发生在核糖体上。细菌的核糖体包含一个较位（30S），大亚单位是由 5S、23S rRNA 和 34 个蛋白组成，小cCoy et al., 2011)。蛋白质的翻译发生在核糖体的 3 个位作用位点为细胞 30S 核糖体亚单位的 16SrRNA 解码区的s 亚基发生点突变介导的 2-脱氧链酶胺类 AGs 耐药多发生菌属的核糖体操纵子为单拷贝，当编码 16S rRNA 的 rrs 基守区（相当于 E.coli 的氨基酸 912 区和 530 环），这将导致(Magnet and Blanchard, 2005)。Nessar 等对化脓分枝杆菌 1研究表明，除已知的 A1408G 突变位点外，还有另外三个 09T 和 G1491T），其中 1406 和 1408 位突变为耐药表型，sar et al., 2011)。 甲基化作用
链霉素生物合成途径及主要中间产物信息Fig.2-1Streptomycinbiosynthesisandthemainintermediates
本文编号：2782449
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X787
【图文】：
图 1-1 氨基糖苷类抗生素的化学分类Fig. 1-1 Chemical classification of aminoglycosidesIshii 等(Ishii et al., 2008)应用弱阳离子交换 SPE（weak cation-exchange carboxypropyl SPEcartridge）净化了组织和内脏中多种 AGs，Almeida 等(Almeida et al., 2012)应用同样的 SPE 模式（BakerBond SPE Wide Pore CBX 和）处理肾脏样品中多种 AGs，Gremilogianni 等(Gremilogianniet al., 2010)应用弱阳离子交换 SPE（DSC-WCX cartridge Supelco）选择性吸附牛奶中链霉素和双氢链霉素， Bohm 等(Bohm et al., 2012)应用聚合物材料 SPE（Bond Elute Plexa cartridge ,Agilent）测定了蜂蜜中链霉素和双氢链霉素，Bohm(Bohm et al., 2012)和 Gbylik 等(Gbylik et al., 2013)利用反向萃取模式 SPE（Waters Oasis HLB SPE）开展了苹果中链霉素和鱼肉中多种 AGs 的测定。此外，一些研究者应用基质固相分散（MSPD）和分子印迹（MIP）(Ji et al., 2013)开展了 AGs 的前处理研究。由于 AGs 结构中缺少发色基团并具有强亲水性，在应用反相色谱（RPLC）分析时，为了改善可测定性和分离效果，常在柱前或柱后进行衍生化处理(Serrano and Silva, 2006)。离子对色谱（IPLC）和亲水色谱（HILIC）能够解决 AGs 色谱难保留的问题。由于 HILIC 流动相中使用缓冲盐数量少或多为挥发性缓冲盐，因此相对于 IPLC 更适合与质谱（MS）联用。毛细管电泳（CE）也适合与 MS 联用。使用柱前延生化将发色基团连接到 AGs 上能够改善其色谱保留特性，从而能
图 1-2 氨基糖苷类抗生素耐药机制示意图Fig. 1-2 Schematic overview of mechanisms of resistance toAGs突变修饰酶改变抗生素作用位点（核糖体），使药物难以与位点蛋白质翻译都发生在核糖体上。细菌的核糖体包含一个较位（30S），大亚单位是由 5S、23S rRNA 和 34 个蛋白组成，小cCoy et al., 2011)。蛋白质的翻译发生在核糖体的 3 个位作用位点为细胞 30S 核糖体亚单位的 16SrRNA 解码区的s 亚基发生点突变介导的 2-脱氧链酶胺类 AGs 耐药多发生菌属的核糖体操纵子为单拷贝，当编码 16S rRNA 的 rrs 基守区（相当于 E.coli 的氨基酸 912 区和 530 环），这将导致(Magnet and Blanchard, 2005)。Nessar 等对化脓分枝杆菌 1研究表明，除已知的 A1408G 突变位点外，还有另外三个 09T 和 G1491T），其中 1406 和 1408 位突变为耐药表型，sar et al., 2011)。 甲基化作用
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