F-53B对斑马鱼甲状腺功能和抗氧化能力的影响及机制研究

发布时间：2020-08-08 02:11

【摘要】：在电镀行业,特别是镀铬工艺中,普遍采用全氟辛烷磺酸盐(PFOS)作为酸雾和铬雾抑制剂。近年来,随着PFOS在全球范围内的进一步限制甚至禁用,全氟烷基醚磺酸盐(F-53B)作为PFOS的替代品在电镀行业得到广泛使用。2009年,F-53B在我国电镀行业的使用量达20~30吨,而目前我国对F-53B缺乏专门的排放要求和有效减量化处理措施,因此几乎所有的电镀企业都未对F-53B进行减量处理,最终导致其大部分进入了水环境中。鉴于F-53B在环境介质中频频检测出且具有较高的生物富集能力,因此,迫切需要对F-53B的水环境生态风险进行科学评估。本研究以斑马鱼为模式生物,以液相色谱-高分辨质谱联用(LC-MS/MS)为检测手段,建立了斑马鱼体内F-53B高灵敏分析方法;进一步地,对斑马鱼胚胎的发育毒性,甲状腺内分泌干扰效应和氧化应激及其作用机制进行了深入研究。主要结论如下:(1)以LC-MS/MS为检测手段,将Eclipase Plus C_(18)(1.8μm×2.1mm×50mm,Agilent,USA)色谱柱首次成功运用于检测斑马鱼幼鱼和成鱼组织中F-53B的含量测定,建立了F-53B的高灵敏分析方法。以选择反应监测(MRM)负离子模式,优化确定F-53B和PFOS的相关特征参数,指出碎裂电压分别为160 V和100 V,碰撞电压分别为30 eV和70 eV,测量的质荷比(m/z)分别为530.8和498.8,特征离子质荷比(m/z)分别351.0和79.9。根据外标法和内标法的相关系数(R~2)0.9999和0.9997可知,F-53B在测定范围内,均有较好的线性关系。通过对精密度和回收率结果表明,低、中、高(10,100,500μg/L)三个浓度梯度的精密度(RSD,relative standard deviation,相对标准偏差)分别为2.53%、3.83%和1.88%,对应回收率分别为86.13±1.28%、90.40±2.86%和89.67±3.10%,由于RSD均小于5%和回收率均大于85%,判断其符合生物样本定量分析的一般要求。(2)F-53B属于中度毒性物质,对斑马鱼胚胎和幼鱼的急性致死性均表现出时间效应,72 h-LC_(50)分别为18.43 mg/L和13.09 mg/L,对应95%置信区间分别为15.81~22.59 mg/L和6.59~17.43 mg/L,说明对F-53B敏感性:幼鱼胚胎。(3)经10 ug/L和100 ug/L F-53B暴露后,幼鱼和成鱼(雌/雄)体内F-53B的吸收量与暴露时间成正相关关系。在暴露阶段,于幼鱼而言,在低、高浓度下,体内F-53B的含量(湿重,下同)分别达2.359 mg/kg和23.046 mg/kg,对应48 h的生物富集因子log_(10)BCF_(48h)值介于2.659到2.693之间,消除速率常数(k)介于0.00268 h~(-1)和0.00287 h~(-1),对应的半衰期相应的介于241.5 h到258.6 h之间。于成年斑马鱼而言:吸收阶段(0~7 d),各组织中F-53B含量与暴露时间呈正相关关系,但未达到富集饱和状态;消除阶段(7~12 d),各组织中F-53B含量随着消除时间逐渐降低。此外,斑马鱼对F-53B的作用,呈现出性别和组织特异性差异现象,即:富集能力:雄鱼雌鱼;雌鱼一致表现为:性腺肝脏鳃脑;雄鱼一致表现为:肝脏鳃性腺脑。在低、高浓度暴露组中,F-53B富集的最高器官分别是雌鱼性腺(分别为5.42和59.19 mg/kg)和雄鱼肝脏(分别为8.98和116.24 mg/kg)。由此推测出,肝脏是F-53B在斑马鱼体内富集的最主要部位之一,鳃因其具有较大的表面积也表现出对F-53B较高的富集潜力。(4)用T-screen检测GH_3细胞显示,F-53B以剂量依赖的方式促进细胞增殖,表明F-53B具有高的甲状腺激素受体(TR)激动活性。通过对斑马鱼幼鱼的激素、基因、Western Blot、同源模建和分子对接等相关实验结果说明:F-53B暴露诱发了显著的发育抑制,在吸收阶段,对于四碘甲状腺原氨酸(T_4),表现出显著性升高;对于三碘甲腺原氨酸(T_3),观察到增加趋势,但没有显著差异;在蛋白表达方面,甲状腺球蛋白(TG)水平降低,而甲状腺转运蛋白(TTR)则显著上调;与下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT轴)相关的大部分基因(crh,tshβ,trβ,dio1,dio2,nis,nkx2.1和pax8等),转录水平均下调;在消除阶段,T_4水平显著增加,TG蛋白水平和基因转录也呈现显著上调现象,TTR没显著变化。采取分子对接的计算机模拟法,分析得到zfTTR/F-53B这种复合物骨架原子的平均均方根偏差(RMSD)为2.31?,且整个系统在10 ns仿真后达到动态平衡;揭示F-53B与TTR蛋白结合,实质上主要是三个氢键与Lys123和Lys115结合。通过对zfTTR/F-53B的定量评估可知,其结合自由能△G_(bind)为-7.36 kcal/mol,且静电能是驱动F-53B与zfTTR结合的主要贡献者。而在分解得到的Leu8、Leu101、Val112、Lys115、Leu125、Pro132、Leu218和Val229等残基中,Leu125是F-53B结合到zfTTR上最重要的一个残基。通过体内、体外和计算机模拟的结果表明:F-53B会干扰甲状腺内分泌系统,且在消除阶段,该效应不能恢复。(5)F-53B对斑马鱼幼鱼和成鱼抗氧化酶系统的影响显示,吸收期,MDA和GSH含量均有所下降,且与暴露浓度呈负相关关系;CAT、SOD、CuZn-SOD和GSH-ST的活性均被抑制,且随着暴露浓度增加,被抑制作用越明显;而GSH-Px活性均被诱导,且与暴露浓度呈正相关关系。在消除期,MDA和GSH含量有所上调,但仍低于对照组;CAT、SOD、CuZn-SOD和GSH-ST这四种酶的活性均有所回升,但整体上仍低于对照组;而GSH-Px活性的被诱导作用有所回下调,但整体上仍高于对照组。可见,F-53B在机体中的积累会对斑马鱼抗氧化系统产生不利效应,对组织功能和细胞的活力产生影响,进而引起多种后续不利的环境效应,因此,需引起我们的足够重视。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X171.5;X781.1
【图文】：

分子结构式,替代品,环境行为

及目的和意义酸盐（perfluorooctane sulfonate，PFOS）广泛运艺中，PFOS 是酸雾抑制剂和铬雾抑制剂的重要年来，关于 PFOS 所带来的环境问题日益突出，业的使用受到限制甚至禁止使用。这种限制使替代品的高度重视，随着带来的相关的研究、生形成明显对比的是对替代品的环境行为、生物不够。因此，关于 PFOS 替代品的环境行为和相、研究热点。基醚磺酸盐（6:2 Chlorinated polyfluorinated e名 F-53B）作为 PFOS 的一种重要的替代品，其在如图 1.1 所示。

生物体,有毒物质

第 1 章绪论氧化还原酶（Prx）等转变为 H2O 和氧原子。H2O2是一种小的、不带电荷和能够自由扩散的分子，在细胞受到外界刺激时，能迅速的生成和降解。同样，也有研究表明，H2O2是细胞内广泛存在的信号分子，它参与了细胞内的许多分子活动，包括钙依赖的蛋白磷酸化、蛋白络氨酸磷酸化、电压门 K+通道、钙离子的流入和流出等。这些细胞活动在细胞生长、增殖、发育、分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有非常重要的作用。对此，近期有研究指出，F-53B 会导致斑马鱼胚胎孵化延迟、畸形率增加并降低存活率[55]，然而，关于 F-53B 诱导产生这些发育毒性的作用机制，却尚未阐明。Shi 等[69]就研究指出，引起胚胎发育毒性的主要原因很可能就是氧化损伤造成。正常生理情况下，生物体可通过自身抗氧化防御系统清除由外源有毒物质诱导产生的氧自由基，起到保护机体的作用；但是一旦 ROS 产生量超出机体自身的清除能力时，就会对机体产生氧化损伤。

下丘脑-垂体-甲状腺轴,内分泌系统,甲状腺,鱼类

图 1.3 下丘脑-垂体-甲状腺轴Fig1.3 The hypothalamic-pituitary-thyroid axis在鱼类中，HPT 轴调控着甲状腺内分泌系统功能，其主要是通过调节甲状腺激素的合成、分泌、转运及代谢来实现调控甲状腺激素生物动力学效应[81]。这与其它动物下丘脑分泌甲状腺激素释放激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）不同的是，鱼类通过下丘脑合成促肾上腺激素释放激素（corticotropinreleasing hormone，CRH），释放到垂体，刺激垂体产生和释放促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH），TSH 作用于甲状腺促进甲状腺激素（THs）的合成。鉴于 THs 在脊椎动物正常发育和生理功能中的关键作用，通过鉴别可能对甲状腺功能和 TH 信号传递产生不利影响的环境化学物质，并评估其对动物和人类的风险显得至关重要。当前，针对甲状腺内分泌干扰物（THDCs）的分子机理研究，主要是集中在甲状腺激素受体水平和甲状腺激素转运水平等两方面[58,59]。彭开良等[82]研究指出，过氯酸氨（AP）可以通过抑制 TPO 基因的表达反馈性地引起促甲状腺激素水平升高。BROWN 等[83]的研究也证实，TPO 活性的抑制会阻碍甲状腺激素的

【参考文献】