三氯乙烯污染地下水厌氧生物修复研究

发布时间：2020-08-09 21:59

【摘要】：三氯乙烯作为一种重要的工业溶剂由于其优良的性质曾被广泛应用于金属脱脂、干洗、农药杀虫、医药麻醉等领域,通过毒理学实验发现其可对人体和环境生物造成危害,已被许多国家列入“优先控制化合物”和“疑似致癌物质”名单,但在使用过程中由于人为的不正当处置以及泄露已被大量释放到地下水环境中成为最常检出的含氯有机污染物,因此急需对三氯乙烯污染地下水进行修复。生物厌氧还原脱氯是众多技术中成本较低且对环境友好的修复技术。但运用于实际的微生物资源还相对较少,对混菌的研究了解相比于单菌也相对匮乏,特别是国内还尚无相关报道。因此本论文以一组驯化培养的能将TCE完全脱氯降解为ETH的混菌为研究对象,首先对其降解特性及分子生物学特性进行比较系统全面的分析。在此基础上,进一步研究了其在不利环境胁迫条件下的适应性,并运用碳-特定化合物同位素比值分析技术研究了该混菌在降解含氯乙烯过程中的13C稳定同位素分馏规律,最后通过室内模拟研究了生物激活以及生物强化方式原位修复TCE污染地下水的效果。在对该混菌降解特性及分子生物学特性进行研究后发现,该菌能利用甲醇、乳酸钠,氢气(+乳酸盐)等不同的基质作为电子供体将TCE还原脱氯为对环境无害的终产物ETH,降解TCE的同时有甲烷生成。此外,该菌能降解所有类型的含氯乙烯,由此表明该菌是一组产乙烯脱卤球菌和其他非脱氯菌共存的混菌,且体系中可能同时存在不同类型的产乙烯脱卤球菌。该混菌在低温、酸性等不利条件下脱氯速率降低,但最终可将TCE缓慢的转化为终产物ETH。动力学实验表明混菌对TCE、cis-1,2-DCE的最大降解速率大于VC,而半速率常数表明混菌在还原脱氯过程中对三种氯代乙烯的亲和力差异不明显。宏基因组测序群落结构分析表明混菌中除了产乙烯脱卤球菌,其他非脱氯菌包括为其提供电子供体、碳源的如醋酸杆菌属和与其竞争的产甲烷菌等,且这些非脱氯菌的相对丰度要远远大于产乙烯脱卤球菌属。特异性PCR技术也检测到产乙烯脱卤球菌的存在,且证明该混菌中同时共存多种含氯乙烯还原脱氯功能基因。该混菌中脱氯功能菌和非脱氯菌共存,为了分析非脱氯菌可能起到的作用以及与功能菌的关系,我们进一步对该混菌在不利环境胁迫条件下的适应性进行了研究。结果表明,混菌在培养基中钴胺素缺乏的条件下仍然能够彻底还原TCE至ETH,在不含钴胺素的培养基中继续加入2-溴乙烷磺酸钠及氨苄青霉素分别抑制混菌中的古菌和细菌后,前者虽然降解速率变慢,但TCE仍能完全转化为ETH,而连续添加氨苄青霉素的处理TCE不能转化为ETH,加入钴胺素后恢复正常。宏基因组测序结果表明混菌中的未分类的冻球菌属和未分类的螺旋体科是最有可能合成该物质的细菌。氧气的加入使混菌降解TCE速率受到抑制,但随着氧气的消耗,脱氯反应被重新启动且最终转化产物中有ETH的生成;荧光定量PCR结果显示混菌中含vcr A基因的产乙烯脱卤球菌相比于含tce A基因的产乙烯脱卤球菌对氧气更敏感;混菌中多种非脱氯可共同发挥作用负责氧气消耗使TCE的还原脱氯被重新启动;可逆性实验表明暴露氧气的混菌重新正常培养可以恢复到与正常条件相似的水平。混菌中的脱氯菌负责转化TCE至终产物ETH,而其他共存的非脱氯菌虽然未参与直接还原脱氯,但对维持体系的相对稳定扮演着重要的作用,因此在复杂不利胁迫环境下,混菌相比于单菌具有更强的稳定性和适应性。在进行修复效果评价时,常规的浓度监测往往受到如吸附、稀释、挥发、溶解等物理因素的影响,近年来运用碳-特定化合物同位素比值分析技术(C-CSIA)可以有效的区分物理以及生物化学作用,但关于复杂混菌的同位素分馏规律还不明确。通过对该混菌的13C稳定同位素分馏规律进行研究发现:混菌在降解TCE及cis-1,2-DCE过程中均产生碳稳定同位素分馏效应,且cis-1,2-DCE反应过程中13C富集作用强于TCE。标准培养条件下混菌对TCE及cis-1,2-DCE的碳同位素富集因子分别为-7.24±0.59‰和-14.60±1.71‰。培养条件、群落组成等因素的改变不会造成该混菌碳同位素富集因子的变化,不同处理之间拟合得到的碳同位素富集因子在95%置信区间内无显著性差异,表明该混菌的碳同位素富集因子具有一定的特异性及稳定性。该混菌中含tce A和vcr A基因的产乙烯脱卤球菌共存,由于不同种类的脱氯菌降解TCE时往往得到不同的碳同位素富集因子,表明混菌中的两种产乙烯脱卤球菌可能分别负责TCE降解的不同阶段。同位素比值分析技术能有效的去除物理因素的干扰,且仅需要对目标物质进行研究分析,在生物降解效果的预测上具有较强的适用性和较高的准确性。最后通过室内模拟研究了生物激活以及生物强化方式原位修复TCE污染地下水的效果。结果表明,沿水流的对流作用以及受重力影响的向下迁移是影响TCE在模拟槽内分布的两个主要因素。在33周的模拟修复中,生物激活对TCE的还原脱氯起到的效果不显著。生物强化方式从第19周开始在水流下游监测井中检测到脱氯产物cis-1,2-DCE,VC和ETH。土著菌中的微生物种类复杂多样,电子供体的添加对某些微生物起到一定的激活效果。但土著菌中不含有能将TCE完全转化为ETH的产乙烯脱卤球菌属,需要通过添加强化菌的方式起到预期的脱氯效果。模拟槽内相对较低的温度(8-15oC)和由此导致的低功能微生物含量是可能导致生物强化修复TCE还原脱氯启动延长的原因。碳稳定同位素分析结果表明物理因素影响模拟槽内的TCE浓度分布及变化,但不会造成碳稳定同位素分馏现象。还原脱氯启动前模拟槽内稳定的13C同位素含量表明TCE不存在其他转化降解途径。降解启动后运用不同方法计算的到的降解率各不相同,碳同位素分析技术表征本质上由生物作用所造成的TCE降解,基于该方法得到的降解率反映了生物作用所造成的TCE降解。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X523
【图文】：

吉林大学博士学位论文dehalorespiration，halorespiration 或 chlororespiration）[47, 48]。如图 1.1 所示E 在第一步脱氯取代中可以转化为 cis-1,2-DCE 和 trans-1,2-DCE，而后继续形成 VC、ETH[49]。各脱氯步骤释放的能量分别为-166.1 KJ/mol，-144.8 KJ及-154.5 KJ/mol[50]。

技术路线

图 2.1 宏基因组分类测序项目流程图Fig. 2.1 The flow diagram of metagenomic analysis用于群落结构分析的核基因组总 DNA 采用 E.Z.N.A. 土壤总 DNA 提盒进行提取（OMEGA, USA）。提取后收集的总DNA用Qubit2.0检测DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性后根据测定的浓度结果确定PCR反应的板量。反应体系为 50 μL，用引物 338F 5’-barcode-ACTCCTACGGGAGGA-3’和 806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’对细菌和古菌 16S rRV3-V4 可变区分别进行扩增。引物中的条形码（barcode）为 7 碱基序列编码标签，每一个样品采用特异性的条形码对后续不同样品间的测序序列行区分分类。具体的 PCR 体系及温度程序详见上海海生工生物工程股份司官网高通量测序服务详细说明（http://www.sangon.com/services_ngs.htm

本文编号：2787611