第二松花江典型氯代烃类污染物的微生物降解研究

发布时间：2020-08-12 01:10

【摘要】： 第二松花江中的氯代烃类污染物种类较多、结构多样,且绝大多数具有毒性大、难降解、易于生物富集等特点,并且可通过食物链的生物放大作用对其它的生物,甚至对人类产生危害。对水环境污染进行修复以降低风险和防止这类物质通过人类产生的各种废物进入环境是防治氯代烃类污染物污染水体的两个重要研究方面。微生物在降解转化这类物质,使其脱毒和无害化方面具有独特的地位。本文采用富集技术,分离纯化出了对氯代烃类化合物具有较强降解活性的降解菌株,利用分子生物学手段进行了鉴定,研究了菌株在纯培养、砾间接触氧化法和微宇宙模拟系统中的降解活性和特点,主要结论如下: (1)通过选择性富集培养技术分别分离出了对氯苯、硝基苯和六氯丁二烯具有很好降解性能的菌株CB001、NB001和HL1。通过菌落特征观察,部分生理生化指标的测定,16S rDNA序列测定和系统发育分析,分别被鉴定为Acinetobacter calcoaceticus、Pseudomonas putida、Serratia marcescens。 (2)菌株CB001和HL1降解各自基质的最佳pH值范围为7.0—8.0,菌株NB001降解基质的最佳pH值范围为7.0—7.5。菌株CB001、NB001和HL1降解基质的共同最佳温度范围为25.0℃—30.0℃;菌株CB001在温度为40.0℃时,仍然能够保持较高的降解活性;三株降解菌在低温条件下经过一段时间的适应,对基质表现出很好的的降解潜力。驯化对菌株降解基质的效率产生重要的影响作用。 (3)纯培养条件下,菌株的生长都经历了迟缓期、加速期、对数期和稳定期等过程,基质浓度的变化程度同样经历了缓慢、快速、缓慢的过程,其中菌株CB001和NB001在对数生长末期时对基质的降解速率最大。菌株CB001降解氯苯的过程中伴随着氯离子的释放,释放量基本符合化学计量关系,其粗酶液中邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性非常高,推断菌株CB001是通过邻位开环裂解途径降解氯苯。菌株NB001降解硝基苯的过程中伴随着亚硝酸根离子的释放,亚硝酸根离子的释放量和硝基苯降解量之比的范围在0.42—0.63之间,制备的粗酶液中邻苯二酚2,3-双加氧酶的活性非常高,推断菌株NB001通过间位开环裂解途径降解硝基苯。菌株HL1降解六氯丁二烯的的过程中伴随着氯离子的释放,但释放量偏离化学计量关系。三株降解菌在纯培养条件下,对基质的降解过程均符合一级动力学方程,氯苯、硝基苯、六氯丁二烯的一级反应速率常数最大值分别为0.0376 h~(-1)、0.0330 h~(-1)和0.0237 h~(-1),生物降解半衰期最小值分别为18.43 h、21.00h和29.24 h。 (4)葡萄糖对菌株HL1降解能力的促进作用强于对菌株CB001和NB001降解能力的促进作用,共代谢是葡萄糖提高菌株HL1对各基质降解能力的一个重要机制。葡萄糖可增加降解体系中氯离子的释放量,但对亚硝酸离子的释放量起到一定的削减作用。 (5)在单一基质条件下,菌株CB001对其它氯苯类化合物的降解能力大小顺序为:1,3-二氯苯＞1,2-二氯苯＞1,4-二氯苯＞1,2,3-三氯苯＞1,2,4-三氯苯＞六氯苯;菌株NB001对其它硝基苯类化合物的降解能力顺序为:2-硝基甲苯＞3-硝基甲苯＞4-硝基甲苯＞2,4-二硝基甲苯＞2,6-二硝基甲苯;菌株HL1对三氯乙烯的降解能力大于对四氯乙烯的降解能力。菌株NB001和CB001的混合菌对氯代硝基苯类化合物作为单一基质或共存条件下均产生一定的降解作用,降解能力的大小为:间氯硝基苯＞对氯硝基苯＞邻氯硝基苯。 (6)直接利用从松花江中采集的砾石进行挂膜,菌膜对江水中的基质的去除起到了明显的作用,其中对六氯丁二烯的降解能力最强;菌膜对基质的去除能力随着培养温度的升高而增强,但在低温环境下经过适应后,对基质也可产生一定的降解效果。砾石表面吸附和江水中的微生物对系统中基质的去除起到了积极的促进作用。 (7)底泥明显促进了微宇宙模拟系统中基质的生物降解效果,其中对六氯丁二烯降解的促进作用最明显,并且在降解初期和降解后期的贡献作用较大。光照对微宇宙模拟系统中基质的去除具有一定的作用,其中对于氯苯和硝基苯降解的促进作用最明显。微宇宙模拟系统中基质浓度的降低主要是由于生物降解导致的,其中驯化分离的降解菌的降解作用明显大于水体中其它降解菌的降解作用,降解菌在模拟系统中有着较强的定殖能力,基质的存在有利于保持菌株在数量上的优势,但无基质存在的情况下,在一定时间内仍可保持数量上的优势,相比而言,菌株HL1的定殖能力稍差。温度在25—30℃之间时,模拟系统中基质的消失随着温度的升高而增加,但在低温环境下,延长培养时间后发现菌株对基质仍然可产生明显的降解效果。降解初期,悬浮物对微宇宙模拟系统中基质的去除发挥着重要的作用,对于菌株HL1而言,这种促进作用可保持到降解末期,但对于菌株CB001和NB001而言,从降解中期开始,这种促进作用逐渐降低。 (8)Cd~(2+)和Hg~(2+)的浓度达到5.0 mg/L时,对两种模拟系统中基质的降解均产生一定的影响,达到10.0 mg/L时,分别产生显著和极显著的抑制作用,其中Hg~(2+)的抑制作用大于Cd~(2+)的抑制作用。两种模拟系统中,营养盐的加入对基质降解起到了明显的促进作用。对于砾间接触氧化法模拟系统,这种促进作用随着营养物质加入量的增加而增强。在微宇宙模拟系统中,营养盐的加入量达到一定程度时,降解率不再随营养程度的增加而明显增加,营养盐的加入对六氯丁二烯降解的促进作用最低。 (9)经过一定适应程序的驯化,菌株CB001对两种模拟系统中共存条件下的氯苯、1,3-二氯苯、1,2-二氯苯、1,4-二氯苯和菌株NB001对共存体系中的硝基苯、2-硝基甲苯、3-硝基甲苯、4-硝基甲苯、2,4-二硝基甲苯、2,6-二硝基甲苯均具有一定的降解效果,其中对单硝基甲苯类化合物的降解能力强于对双硝基甲苯类化合物的降解能力。在两种模拟系统中,菌株NB001和CB001的混合物对氯代硝基苯类化合物都保持着较好的降解效果。菌株HL1对共存体系中的六氯丁二烯、三氯乙烯和四氯乙烯的降解效果最好。菌株CB001、NB001和其混合菌株在微宇宙模拟系统中对基质的降解效果强于砾间接触氧化法模拟系统,而菌株HL1则刚好相反。三株降解菌的混合物对共存的可被降解的氯代烃类化合物的降解能力大小顺序为:氯代烯烃类化合物的降解效果最好,其次为氯苯类化合物,氯代硝基苯和硝基苯的降解效果最差。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：X522
【图文】：

示意图,生物修复,模拟系统,示意图

体积为830d，江水/底泥 =5.5:1(v/v)。生物降解过程中，降解菌的初始浓度大约为3、10scFu/tnl，光暗比为10:14，并用搅拌器在水面下 2.0cm处轻轻搅动，不要搅动污泥，以便更准确地模拟松花江水体(见图2一l)。二二二土士乒北产产二二二二二二二二2弓省省卜卜--——一—一一—月月‘‘ ...搅拌器江水降解菌底泥菌月妒一二二圣二告二二二二凑凑韶8ors韶8韶888韶8咫咫微宇宙模拟系统砾间接触氧化法模拟系统图2一l生物修复模拟系统示意图Fig.2一 1Sehematiedlagran招 oftheslrnulatedbioremediationsystem2.3.3砾间接触氧化法模拟系统中基质的生物降解本实验使用的菌株和基质为单一菌株和菌株驯化时所用的单一基质。2.3.3.1模拟系统的组成和结构对生物降解的影响(1)挂菌膜的不同砾石对基质降解的影响:分别将经过处理和未经过处理的挂有菌膜的砾石和实验用江水以体积比为1:4的比例进行组合，加入模拟系统中，基质的初始浓度大约为50.0m留L。于25.0℃下培养，在规定的时间内采集水面下 2.0cm处的水样，分析基质的浓度，计算出降解率。(2)菌膜和砾石对模拟系统中基质降解的作用:分别将无菌膜和挂有菌膜的未经处理的砾石加入模拟系统中，同时做不加砾石，只加入基质的对照处理。基质的初始浓度大约为50.om酬L，25.0℃培养，在规定的时间内取水面下 2.0cm处的水样

菌株,产物,琼脂糖凝胶电泳,序列同源性分析

3.2.2165rDNA序列同源性分析采用通用引物对所驯化和纯化的三株细菌CB001、NB001和HLI的 165rDNA基因进行了PCR扩增，分别获得了具有单一条带的扩增产物，如图3一1所示，其大小分别约为 1450bp，与预期大小相符。2000图3一l菌株CB001、NBO01和HLI的 165:nNAPCR产物的琼脂糖凝胶电泳图0，l泪性对照l，菌株CB001的 165rDNAPCR产物2，菌株NBOOI的16SrDNAPCR产物M，DNA分子量标准DL20003，菌株HLI的 165rDNAPCR产物Fig.3一 1.AgamsegeleleetroPhoresisofthePCRProduetsofStrainCBOOI

对氯苯,菌株,降解能力,六氯苯

东北师范大学博士学位论文(l)菌株CBool对氯苯类化合物的降解菌株CBO01对氯苯及其同类物质的降解及其氯离子的释放如图3一18。以氯苯类化合物为唯一碳源和能源的培养条件下，菌株对不同基质的降解能力随着氯取代基的增加而降低，其中对二氯苯表现出了较高的降解能力，基质的降解率在69.4%一82.8%之间，但对三氯苯和六氯苯的降解能力较低，其中对六氯苯的降解率只有6.5%，几乎没有降解活性。这可能由于氯原子有很强的吸电子性，苯环的电子云密度降低，亲电的氧化酶很难从苯环上获得电子而发生氧化反应，氯取代基越多，苯环上的电子云密度越低，越难被氧化。将loom留L葡萄糖作为初级营养基质加入到培养体系后

【引证文献】