基于Pseudomonas sp. T13强化的好氧反硝化系统构建及脱氮效能研究

发布时间：2020-08-13 00:28

【摘要】：随着我国城镇化和工业化进程的发展,生活污水和工业废水排放量增加,“十三五”规划在提高污水排放标准的同时,提出了控制总氮排放量的新要求,为此高效生物脱氮技术的研究与开发再度成为研究热点。目前已建的污水处理厂急需升级改造,强化提升硝酸盐氮的去除是生物脱氮技术的难点。本研究基于好氧反硝化菌能够将硝态氮或亚硝态氮在同一反应器中完成硝化反硝化,易于与现有好氧工艺进行衔接改造的潜在优势,利用好氧反硝化菌具有生长速度快、适用氮浓度范围宽、水质环境适应性强的特点,针对当前缺乏高效好氧反硝化菌株资源以及生物强化系统中的菌群竞争问题,从长期运行的废水处理系统中分离获得一株高效好氧反硝化菌,基于菌株多相分类鉴定和反硝化动力学分析;构建了好氧反硝化菌与固定化载体相结合的生物强化工艺,分别应用于低氮素的生活污水和高氮工业废水的脱氮研究;借助高通量测序技术和微生物网络分析方法探讨了目标菌株的演替变化,分析了生物强化工艺中主要反硝化功能菌的多样性和功能作用,为好氧反硝化技术理论向实际转化提供实验依据和技术指导。通过连续曝气和间歇曝气相结合的方式定向驯化、筛选获得一株高效好氧反硝化菌Pseudomonas sp.T13,采用响应面法优化好氧反硝化过程中的关键影响因子(温度、pH、碳氮比和溶解氧),当温度为30℃、pH 7.0、C/N为7:1、溶解氧为2.5 mg/L时,T13的硝酸盐去除率可达到90%以上。对Pseudomonas T13进行全基因组测序,表明好氧反硝化菌T13具有高效硝酸还原功能基因,硝酸盐还原酶的检测发现硝酸盐还原酶比例占脱氮酶基因的30%以上。利用Logistic方程和双Monod模型构建了菌株T13的生长动力学模型和反硝化动力学模型,描述了菌株T13的微生物生长动力学过程及底物与反硝化作用关系,充分揭示好氧环境下反硝化菌的动力学规律,为菌株T13强化好氧反硝化系统构建提供重要的理论支持。采用活性炭-聚氨酯载体构建了Pseudomonas sp.T13生物强化流化床反应器,以预挂膜的方式启动反应器处理低氮素的生活污水,对反应器运行条件进行优化,分析了生活污水的功能菌群对T13的竞争影响。T13预挂膜反应器对生活污水中总氮去除率达到89±4%,较未经过预挂膜的生物强化反应器高8%,其中硝酸盐去除率在预挂膜强化反应器中达到93±7%,未预挂膜系统为88±7%,生活污水中氨氮含量较低,在好氧反硝化条件下氨氮去除率分别达到93±1%和97±1%,出水的亚硝酸盐分别达到1.1 mg/L和0.7 mg/L,出现亚硝酸盐积累。对持续两个月工艺运行的群落监测,分析了生物载体所附着T13与生活污水中其他菌群的演化过程。分析发现,系统中Brucella和Brevundimonas的同时富集,导致后期一个相对较低的总氮去除率,且发生亚硝酸盐残留,分析认为Brevundimonas与Pseudomonas stutzeri的代谢过程类似,在高溶解氧条件下会形成亚硝酸盐的积累,因此在COD不足时更容易造成总氮去除率降低。针对含有高浓度的硝酸盐和亚硝酸盐的煤制乙二醇工业废水难以实现有效生物脱氮处理的问题,采用T13构建的好氧反硝化工艺研究了不同进水负荷对强化菌株的冲击和影响,采用生物网络分析的方法对目标菌株与其他脱氮菌群关系进行了揭示。通过煤制乙二醇废水的生物毒性试验分析表明,在活性炭-聚氨酯载体中附着的生物菌群比悬浮菌群具有更良好的抗高浓度冲击能力。在进水浓度为实际废水50%以下的浓度条件时,硝酸盐去除率可以达到50%,COD去除率达到65%以上,进一步增加进水负荷导致总氮(TN)去除率降低20-30%,主要是降低了硝酸盐和亚硝酸盐的去除率。基于napA基因的脱氮过程分析表明当载体生物膜中Pseudomonas sp.T13的比例低于10%时,硝酸盐和亚硝酸盐去除率明显降低,随着高硝氮煤化工废水处理时间的持续延长,假单胞菌降低的同时伴随着其它脱氮菌Paracoccus、Brevundimonas和Brucella等的生长和富集。研究表明生物载体能够提升好氧反硝化过程的总氮去除效率,在载体内部形成溶解氧的梯度浓度变化,为反硝化过程提供一个有效的好氧至厌氧的反应区域,在载体外层具备较充分的氧气,促进好氧反硝化菌的生长及硝酸盐的还原,并在内部低氧或厌氧条件下实现好氧反硝化过程中的亚硝酸盐还原。采用载体预挂膜附着T13的方法有效强化了工艺的总氮去除效果,而采用目标菌株与污水混合的强化方式会因其它功能菌群的竞争导致目标菌的快速衰减,从而无法形成特定的目标菌,影响TN去除效果。因此,在未来的群落功能组建中考虑载体传质过程对硝酸盐的去除影响可指导生物反应器的调节和优化。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X703
【图文】：

凝胶电泳,实时荧光定量PCR,混合液,试剂

napA 16S图2-3 PCR凝胶电泳图Figure 2-3 PCR gel electrophoresis实时荧光定量PCR仪（ABI 7500 FAST，美表2-18 PCR反应混合液Table 2-18 Mixture of PCR reaction试剂（浓度）用量μLDNA模板 0.5dNTP (10 mmol/L) 0.5Taq Buffer (10×) 2.5MgCl2(25 mmol/L) 2Taq Polymerase 0.2PCR-grade pure H2O 18.3Primer F (10 μmol/L) 0.5Primer R (10 μmol/L) 0.5

曲线,微生物群落

第 2 章实验材料与方法DOTUR和Phylip等软件计算矩阵距离并由此进行聚类分析，根据97%相似性划分分类操作单元 (operational taxonomic units，OTU)，获得rarefaction 曲线，计算评估丰度评价指数（Chao1）和多样性指数（Shannon）[129]；再利用RDP na veBayesian rRNA classifier和Greengenes classify在线分类，结合BLAST比对确定所测的序列分类地位。所获得高通量测序原始数据上传并公开于NCBI网络公开数据库（Short Read Archive (SRA) database），获取数据查阅登录号PRJNA310145。2.2.6.4 菌群网络构建及分析（Cytoscape network）基于Illumina 高通量测序获得的OTUs数据，采用Cytoscape 3.2.1进行网络构建[121]。相关操作如图2-5所示。

菌落形态,细菌培养物,形态特征

0201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22菌株编号00.2去图 3-3 分离获得 22株脱氮菌对总氮和硝氮去除能力比较Figure 3-3 Comparision of TN and NO3- N removal by 22 strains3.2.3 好氧反硝化菌多相分类鉴定3.2.3.1 好氧反硝化菌的形态特征通过平板划线法选取单菌落，得到形态特征相同、均匀分布的细菌单克隆培养物，并进行革兰氏染色，如图 3-4。根据《伯杰氏细菌手册》首先观察微生物群体形态。在固体培养基中培养 24 h 后，观察发现菌株 T13的单菌落为圆形、不透明的淡黄色，直径大小在 1.5-3.5 mm 之间，菌落边缘不太规则，表面为凸起的褶皱，菌间具有一定粘性，具体菌落形态结果见表 3-1。对菌株进行革兰氏染色显示为红色，则该菌为革兰氏阴性菌。

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