海绵附生微生物对底栖硅藻附着性能的影响
发布时间：2020-08-14 10:12
【摘要】：生物污损在全球范围内每年造成的经济损失高达几百亿美元,生物污损防治成为世界范围的难题。传统防污漆中的毒性化合物由于毒性大、难降解,使用受到越来越严厉的控制,寻找高效的环境友好的抗污损化合物成为目前迫切需要解决的问题。海绵具有抵御生物污损的化学防御机制,越来越多的研究发现,海绵的抗污损活性物质的真正生产者是其附生微生物,因此海绵附生微生物成为寻找抗污损天然产物的良好来源。微型生物污损——生物膜对大型污损生物的附着和后续生长起关键作用,并最终导致复杂的污损生物群落的形成,若前期生物膜演替过程被阻止则后续大型生物,特别是硬壳生物的附着将被阻止,因此对材料表面初期微型生物污损进行防控,不仅能够避免生物膜带来的危害,而且能够防止大型污损生物的附着。在光线能照射到的范围内,生物膜的主体是微型植物——硅藻。因此,在生物污损防治中抗硅藻附着是避免后续大型生物附着的必须和关键的一步,开发对包括硅藻在内的各种污损生物广谱有效的抗污损材料,是解决生物污损问题的必然途径。硅藻的壳缝系统和胞外多聚物(EPS)对于生物膜的形成和发育具有重要作用,都是影响底栖硅藻附着的重要因素。本研究以抗硅藻附着的活性菌株和活性菌株粗提物为工具,以底栖硅藻形成的生物膜和分泌的胞外多聚物为研究对象,研究底栖硅藻在菌株或粗提物干扰下,附着性能受到的影响。用抗硅藻附着生物测试方法,从海绵附生微生物菌库中筛选出活性菌株；用活性菌株和底栖硅藻进行菌藻直接接触的对峙试验,确定菌株抗硅藻附着的活性来源；用活性菌株粗提物对硅藻进行处理,研究硅藻生物膜的形成情况,以及硅藻胞外多聚物的分泌情况,并对胞外多聚物进行分离纯化,分析其单糖组成和变化,寻找与硅藻附着性能密切相关的单糖或单糖组合。研究的结果如下：1、从美国圣璜岛海绵附生微生物菌库中的224个样品中筛选出24个具有抗硅藻附着活性的菌株集合。对224个样品中已经完成种属鉴定的菌株样品进行多样性分析,它们分属于4个门类23个属,85%的菌株集中在厚壁菌门和变形菌门,Bacillus属的菌株最多。对224个菌株进行活化培养和小规模发酵,获取粗提物。在24孔板中进行粗提物浓度为100μg/mL的抗硅藻附着急性试验,结果发现海绵附生微生物菌株粗提物对硅藻的附着有明显的影响,对硅藻的附着表现出中性、抑制和促进的效果,粗提物的效果与硅藻的种类相关。从抗污损活性即抑制硅藻附着的角度出发,从224个菌株中共筛选出24个活性菌株,粗提物浓度在100μg/mL时,至少能同时抑制四种硅藻附着。从24个活性菌株粗提物中选取5个样品进一步降低浓度,测试粗提物在不同浓度下对两种硅藻Nitzschia closterium和Amphora sp的抑制效果的差异,结果发现,随着粗提物浓度的降低,菌株粗提物抑制硅藻附着的能力也随之降低。所有粗提物样品针对Amphora sp的EC50均高于其针对N.closterium的EC50。也就是说,同一个粗提物样品对不同硅藻附着的抑制效果差别显著。推测不同硅藻对粗提物处理的敏感性差异可能与硅藻的壳缝系统密切相关。为了确定抗硅藻污损天然产物的菌种来源,综合菌株的形态特征和基因序列分析,对两个未知种属的活性菌株进行了菌种鉴定,UST050418-708被鉴定为Psychrobacter arcticus, UST050418-694被鉴定为Microbacterium testaceum。2、本文将活性菌株和附着硅藻共培养,研究菌藻之间的关系。在24孔板中进行4株活性细菌和硅藻Stauroneis sp.直接对峙实验,改变菌藻比例,观测硅藻的附着率。结果发现,菌藻比例高时,各活性菌株抑制硅藻附着的活性明显增强；各菌株在不同菌藻比例条件下,抑制硅藻附着活性最强的部分一般都集中在上清液,而菌体的抑制活性相对较弱,有的甚至有可能刺激硅藻附着,全菌液的活性强弱一般处于上清液和菌体之间。本研究在三角瓶中进行活性菌株UST050418-708和硅藻Stauroneis sp的大体积菌藻对峙试验,共培养16天后发现,活菌和全菌液都有一定的促进硅藻生长的作用,灭活菌对硅藻生长影响不大,而上清液抑制硅藻的生长。同时,活性菌株也影响硅藻的附着,会改变硅藻细胞在生物膜和悬浮部分之间的分布,菌株上清液使附着的硅藻比例减少,活菌体和灭活菌体使附着硅藻的比例增大。推测菌体灭活过程使细菌的细胞破裂并使胞内营养物质或促进硅藻附着的物质释放出来,同时抑制硅藻附着的活性成分在灭活菌体的过程中失活分解,导致附着硅藻比例上升。3、本文用活性菌株UST050418-708的粗提物处理两种硅藻Stauroneis sp和Amphora sp.,然后进行大规模培养,研究活性菌株粗提物对两种硅藻生长、附着的影响,以及对硅藻胞外多聚物EPS的分泌和单糖组成的影响,并比较两种硅藻的反应差异。结果发现,活性菌株粗提物不抑制硅藻的生长,但是影响硅藻细胞在生物膜和悬浮状态的分布。粗提物处理使硅藻Stauroneis sp形成生物膜的细胞比例降低,但对Amphora sp的细胞分布影响不大；硅藻EPS分布的变化与硅藻细胞在培养体系中分布的变化一致；粗提物改变单位硅藻细胞EPS的分泌量,高浓度处理使Stauroneis sp每克干藻的EPS产量大幅上升,而高浓度处理下Amphora sp的每克干藻的EPS产量与对照持平。两种硅藻都出现单位藻细胞的生物膜TB-EPS增加,推测可能硅藻为了保持附着状态,需要产生大量的紧密粘附性EPS来对抗干扰；两种硅藻对粗提物处理的反应程度受硅藻本身生活型的影响。4、将两种硅藻的EPS粗品进行有机溶剂洗涤去脂、Sevage法去蛋白、透析除盐后,经TFA完全酸水解,经PMP柱前衍生化,利用HPLC方法分析EPS的单糖组成并计算各单糖的分子摩尔比。结果发现,两种生活型不同的硅藻EPS的单糖组成不同。硅藻Stauroneissp.的EPS由9-10种单糖组成,总EPS含有9种单糖。按照出峰顺序依次是Man, Glc-N、 Rha、Glc-A、Glc-NAC、Gl、Gal、Xyl和Fuc,不含Gal-A和Ara。Amphora sp.的总EPS由12种单糖组成,除了包含Stauroneis sp.所有的9种单糖和Gal-A外,还含有两种未知单糖。从单糖种类数上看,Amphora sp.比Stauroneissp.的EPS单糖种类丰富。同一种硅藻不同来源的EPS优势单糖不同。硅藻Stauroneis sp.的细胞外粘附性EPS (TB-EPS),来自悬浮细胞的F-TB-EPS和来自生物膜细胞的BF-TB-EPS,两者的第一优势单糖都是GIc,·占比分别达到38%和59%。但是,F-TB-EPS的第二优势单糖是Gal,而BF-TB-EPS的第二优势单糖则是Man。硅藻Amphora sp悬浮细胞的TB-EPS占优势的单糖是Xyl,而生物膜细胞的TB-EPS优势单糖有三种,分别是Man、Glc-A和Gal,三者占比相当。不同硅藻的EPS差异明显,但来源相似的EPS具有一定的相似性。可溶性EPS (SL-EPS)来自于全部细胞,两种硅藻Stauroneis sp.和Amphora sp.的SL-EPS均以Xyl和Glc-A为主要单糖。两种硅藻在对活性菌株粗提物的反应中,变化最小的EPS都是来自全部硅藻细胞的可溶性EPS (SL-EPS)。无论粗提物浓度高低,该部分EPS的优势单糖均没有发生变化,仅仅是优势单糖的占比发生一些变化。从各个部位的EPS总体来看,Stauroneis sp有4种特征单糖,分别是Xyl、Glc、Man和Gal,全部都是中性单糖；Amphora sp.有5种特征单糖,分别是Xyl、Gal、Man,还有Glc-A和GlcN,除了中性单糖,还有糖巍和葡萄糖胺。一般情况下,优势单糖往往是粗提物处理引起变化发生的热点位置,但是也有非优势单糖受到处理后发生明显变化,而成为热点位置的情况。关于硅藻附着性能和单糖组成之间的关系的分析表明,附着性能强的硅藻Amphora sp.的EPS中“氨基己糖+糖醛酸”、糖醛酸、Glc-A的摩尔百分含量均高于附着性能弱的硅藻Stauroneis sp.。尤其是Glc-A,在附着性能强的Amphora sp.的EPS中是优势单糖,在附着性能弱的硅藻Stauroneis sp.中摩尔百分含量相对较低。当进行活性菌株粗提物处理时,摩尔百分含量下降幅度和处理强度在两种硅藻中均一致,说明Glc-A可能和此两种硅藻的胞外EPS的粘性、硅藻附着性能有较大的相关性。本论文的研究成果不仅有利于我们加深对海绵类生物的防污损化学防御机制的理解,还有利于加深我们对污损生物硅藻附着机制的理解,也可以为我们提供高效无毒的抗污损活性化合物来源应用于抗污损技术。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X55
【图文】：
样品邋ＵＳＴ０５０４１８－１００，ＵＳＴ０５０４１８－３１５，ＵＳＴ０５０４１８－３巧，ＵＳＴ０５０４１８－３８０邋和逡逑ＵＳＴ０５０４１８－６８３邋针对邋如ｏｒａ邋ｓｐ．的邋ＥＣｓｏ邋分别是邋１５．４０，邋２１．１９，邋１２．５３，邋１９．扣和邋２１．０７惦／ｍｌ，逡逑而针对Ｗｃ如似乱ｍ的ＥＣｓｏ的分别是３．２２，５．６２，１．４７，３．８８，和８．巧雌／ｍｌ邋（见图２－３）。逡逑所所有样品针对＾ｍｐ＆ｏｒａｓｐ．的ＥＣｓｏ也均高于其针对ｃ／ｏｓｔｏ＇／ｗｍ的ＥＣｓｏ。这些结果逡逑充分说明，由于s暝逯掷嗪蜕硖匦缘牟煌桓龃痔嵛镅范圆煌拊甯阶诺囊种菩у义瞎畋鹗呛芟灾摹ｅ义希玻常戳街昃咭种苨暝甯阶呕钚跃甑闹质艏ㄥ义锨拔乃⑾值幕钚跃曛屑杭ǖ木攴质粲诓煌氖簦渲惺舻能缰瓯冉襄义隙唷Ｔ谂嘌头⒔突钚跃甑墓讨校⑾治粗质舻幕钚跃辏眨樱裕埃担埃矗保福罚埃负湾义希眨樱裕埃担埃矗保福叮梗幢冉弦子谂嘌曳⒔秃蟠徊锏牟恳脖冉洗螅子诨竦米懔看痔嵛铮义弦虼耍运土礁龌钚跃杲辛酥质艏āｅ义希玻常矗卞澹眨樱裕埃担埃㈠澹福罚埃妇涞男翁颜麇义希眨樱裕埃担埃矗保福罚埃妇暝冢校俟烫迮嘌信嘌蔡旌螅翁Ч鄄毂砻骶涑适氚咨义辖残危本叮插澹恚碜笥遥砻婀饣咴嫡耄迹玻矗ｅ义
本文编号：2792894
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X55
【图文】：
样品邋ＵＳＴ０５０４１８－１００，ＵＳＴ０５０４１８－３１５，ＵＳＴ０５０４１８－３巧，ＵＳＴ０５０４１８－３８０邋和逡逑ＵＳＴ０５０４１８－６８３邋针对邋如ｏｒａ邋ｓｐ．的邋ＥＣｓｏ邋分别是邋１５．４０，邋２１．１９，邋１２．５３，邋１９．扣和邋２１．０７惦／ｍｌ，逡逑而针对Ｗｃ如似乱ｍ的ＥＣｓｏ的分别是３．２２，５．６２，１．４７，３．８８，和８．巧雌／ｍｌ邋（见图２－３）。逡逑所所有样品针对＾ｍｐ＆ｏｒａｓｐ．的ＥＣｓｏ也均高于其针对ｃ／ｏｓｔｏ＇／ｗｍ的ＥＣｓｏ。这些结果逡逑充分说明，由于s暝逯掷嗪蜕硖匦缘牟煌桓龃痔嵛镅范圆煌拊甯阶诺囊种菩у义瞎畋鹗呛芟灾摹ｅ义希玻常戳街昃咭种苨暝甯阶呕钚跃甑闹质艏ㄥ义锨拔乃⑾值幕钚跃曛屑杭ǖ木攴质粲诓煌氖簦渲惺舻能缰瓯冉襄义隙唷Ｔ谂嘌头⒔突钚跃甑墓讨校⑾治粗质舻幕钚跃辏眨樱裕埃担埃矗保福罚埃负湾义希眨樱裕埃担埃矗保福叮梗幢冉弦子谂嘌曳⒔秃蟠徊锏牟恳脖冉洗螅子诨竦米懔看痔嵛铮义弦虼耍运土礁龌钚跃杲辛酥质艏āｅ义希玻常矗卞澹眨樱裕埃担埃㈠澹福罚埃妇涞男翁颜麇义希眨樱裕埃担埃矗保福罚埃妇暝冢校俟烫迮嘌信嘌蔡旌螅翁Ч鄄毂砻骶涑适氚咨义辖残危本叮插澹恚碜笥遥砻婀饣咴嫡耄迹玻矗ｅ义
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