有机磷酸酯（OPEs）对赤子爱胜蚓的毒性效应及机制研究

发布时间：2020-08-22 07:39

【摘要】：有机磷酸酯(organophosphorus esters,OPEs),作为应用最广泛的一类有机磷阻燃剂,具有品种多,价格低廉,阻燃效果好等特点,在家具、纺织品、建筑材料和电子产品中大量使用。由于OPEs主要以掺杂混合而非化学键合方式加入到材料中,其大多数具有半挥发性,因此随着OPEs的广泛使用,越来越多的OPEs释放到环境中。近年来,在水体、大气、室内以及土壤中均检测到多种OPEs的存在,其环境和健康风险亟待评估。目前,针对OPEs的生态毒性研究,主要集中在水生生物(包括斑马鱼、大型潘等)和鸟类,而对土壤生物的研究鲜有报道。本研究采用土壤无脊椎动物赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)作为受试生物,通过滤纸接触法和人工土壤法分析了三类不同取代基类型OPEs对蚯蚓的急性毒性及毒性效应,并利用多组学技术重点研究了其中毒性最大的磷酸三正丁酯(TnBP)对蚯蚓的致毒机制。主要研究内容和结果如下:(1)通过滤纸接触法测定了三种取代基类型的OPEs对蚯蚓急性毒性指标LD50,包括氯代烷基类(磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯TDCP和磷酸三(2-氯乙基)酯TCEP)、烷基类(磷酸三甲酯TMP和TnBP)和芳基类(磷酸三甲苯酯TCP),结果发现OPEs毒性大小顺序为TnBPTCP=TMPTDCP=TCEP。(2)利用人工土壤法分别研究了 TCEP、TCP和TnBP对蚯蚓的毒性效应,结果发现3种OPEs在10 mg/kg暴露浓度下对蚯蚓体重增长无显著影响,但能造成蚯蚓组织的损伤。3种OPEs暴露均可扰乱蚯蚓抗氧化酶系统的稳定,产生氧化应激,在1 mg/kg暴露浓度下即可引起蚯蚓体腔细胞DNA断裂。3种OPEs暴露对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性影响差异不显著。通过计算综合毒性指数IBRv2,三种OPEs的综合毒性效应大小为TnBPTCPTCEP,与滤纸法相同。(3)结合转录组学和代谢组学的方法,探究了 TnBP暴露对赤子爱胜蚓肠道损伤的直接作用机制,并选择相应蛋白及基因进行验证。结果显示TnBP可在蚯蚓的肠道组织中积累,影响其结构和消化功能。TnBP使蚯蚓肠道组织内特有的表面活性剂 2-已基-5-乙烷基-呋喃-3-磺酸(2-hexyl-5-ethyl-furan-3-sulfonic acid,HEFS)含量下降,破坏了细胞膜的稳定性;Ca2+-ATPase活性下降使细胞内的Ca2+无法通过Ca2+-ATPase泵出细胞外,导致膜内渗透压升高,进而细胞结构受到破坏。小肠上皮细胞间紧密连接蛋白中的闭合蛋白(occludin)及将跨膜蛋白固定在肌动蛋白细胞骨架上的闭锁连接蛋白-1(Zonulaoccludens-l,ZO-1)表达量显著下调,使细胞间的紧密连接受损。此外,TnBP的暴露明显降低了肠道微生物的多样性,改变了肠道微生物群落结构,显著降低了两种产短链脂肪酸细菌的丰度,引起肠道产短链脂肪酸能力下降,使肠道更易发生炎症反应。(4)通过转录组学和代谢组学的方法,对腹部神经索及头部神经节分别研究,探究了 TnBP暴露对赤子爱胜蚓神经毒性的可能作用机制,并选择相应蛋白含量及基因表达量进行进一步验证。结果发现,TnBP可在蚯蚓神经组织中积累,扰乱兴奋性神经递质谷氨酸的传递,产生兴奋性神经毒性。TnBP使腹部神经索中谷氨酰胺酶的表达量上升,产生大量谷氨酸,并促进突触囊泡对谷氨酸的运输及突触前膜谷氨酸的释放,对谷氨酸受体(GluR)中的离子型受体N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDARs)产生过度刺激,引起神经元产生兴奋性损伤。在此过程中还会导致突触后膜Ca2+堆积,此外Ca2+-ATPase的含量降低,突触后膜的Ca2+无法及时运出胞外,从而引起钙超载,造成神经元的损伤。另一方面,TnBP的暴露会降低蚯蚓头部神经节中谷氨酰胺酶的表达,引起谷氨酸含量降低。Ca2+-ATPase含量的降低使突触后膜Ca2+无法及时运出胞外引起的钙超载,可能是头部神经元损伤的重要原因。此外,Na+/K+-ATPase的下调,使细胞内Na+和Ca2+堆积,引起细胞渗透压失衡,造成神经元损伤。本研究系统地探究了不同取代基类型的OPEs对典型土壤生物蚯蚓的生态毒性效应,并揭示OPEs引起蚯蚓致毒的分子机制,为其污染控制基准和环境评价提供理论支撑。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X171.5
【图文】：

序列,转录组学,实验流程,物种

逦一代高通量测序仪测序，能够获得足够的序列，将所得序列ｐ过比对或者从头组逡逑装形成全基因组范围的转录谱（图１．２）。逡逑ＲＮＡ逡逑ＲＮＡ片段化处ｆｆｌ逡逑｜邋反转录合成ｃＤＮＡ文序逡逑■■■■■■逡逑，，ＤＮＡ测Sl接头连接逡逑ＰＣＲ扩增文作逡逑ｍ逦逡逑。邋深度测印逡逑围像识R%逡逑ｉ＾ｈｈｂｂ邋■■■■■■■邋ｈｈｂｈ逡逑ＲＮＡ序列信总逡逑图１．２邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ实验流程逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ．２邋ＲＮＡ－Ｓｅｑ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ逡逑基于ＲＮＡ－Ｓｅｑ的转录组学己在多个物种的毒理学实验中得到了应用，包括逡逑细胞ｌ９８－１ＱＧ］和个体［１ＧＭ（）３］。但是，针对蚯蚓开展基于ＲＮＡ－Ｓｅｑ的转录组学研究仍逡逑然少有报道，目前为止，仅有一篇涉及安德爱胜蚓转录组的文献ｎＧ４１。Ｙｏｓｈｉｋａｚｕ逡逑１４逡逑

技术路线图,毒性机制,神经系统损伤,滤纸法

酶活测定的方法，研究ＴｎＢＰ引起蚯蚓神经系统损伤的毒性机制。逡逑１．４．３技术路线逡逑本研究基本技术路线如图１．４所示。逡逑—逦邋Ｉ逦逦逦逦逦逦１逡逑－＿篇邋￣、滤纸法逦．ｌｄ５０逦［Ｉ邋ｐ￣逡逑－Ｊ邋？邋Ｌ逦逦？逦Ｈ￣逡逑塑逦ｊ逦vq．逡逑栜逦ｉ￣逦７邋７逦逦逦逦逦逦１邋ｎ逡逑Ｐ邋逦邋１１个体水平逦｜组织损伤逦｜酶活指标逦｜遗传毒性Ｉ１邋0逡逑＾邋毒性逦册１￣￣逦Ｉ邋￣逦￣逦￣ｎ逦！｜逦２逡逑？邋一效邋＾逦＿邋￣￣＊——＾邋，——＊￣￣邋￣￣邋￣￣ｒ逦ｍ逡逑＾逦Ｉ邋体重逦ｈｅ染色逦氧化应激神经递

路线图,研究技术,路线

平台下系统评估不同类型ＯＰＥｓ对土壤生物的生态毒性效应，对ＯＰＥｓ的使用管逡逑理及生态风险评估具有重要意义。逡逑在此科学背景下，本章的研宄思路围绕三个层次展开（图２．１）。首先，选择逡逑三类不同取代基类型的ＯＰＥｓ开展急性毒性研究，包括氯代烷基类（ＴＤＣＰ和逡逑ＴＣＥＰ）、烷基类（ＴＭＰ和ＴｎＢＰ）和芳基类（ＴＣＰ）。通过滤纸法测定五种ＯＰＥｓ逡逑对赤子爱胜蚓而）的ＬＤ５Ｑ值，初步评估其急性毒性。根据测得的逡逑ＬＤ５ｑ，从三种类型ＯＰＥｓ分别选择一种，即ＴＣＥＰ、ＴｎＢＰ和ＴＣＰ开展进一步研逡逑究。通过人工土壤法从不同生物学水平上分析三种ＯＰＥｓ对￡／ｓｅｎ／ａ声汾／ａ的生态逡逑毒性效应，包括从个体水平分析蚯蚓存活率及体重变化特征，从组织水平分析逡逑ＯＰＥｓ引起蚯蚓的组织损伤情况，从分子水平分析ＯＰＥｓ引起蚯蚓的氧化应激效逡逑１９逡逑

【参考文献】