含硫杂环芳烃降解菌的筛选及降解特性研究

发布时间：2020-08-23 11:14

【摘要】：含硫杂环芳烃(PASHs)是原油中硫的主要存在形态,具有强富集性、致癌、致畸、致突变及难以生物降解等特点,潜在威胁着生态系统及人体健康。本研究从含硫杂环芳烃高效降解菌的筛选与鉴定、培养条件优化、代谢途径分析,以及对其它典型污染物的降解特性等方面进行深入系统研究,并对降解菌产生的生物表面活性剂进行结构分析和理化性质研究,最后利用该降解菌对污染土壤进行生物强化修复研究,以期为减缓或消除该类化合物对环境的影响提供理论基础和指导。本研究选择二苯并噻吩(DBT)作为PASHs模式物,从胜利油田长期受石油污染土壤中筛选分离得到5株降解单菌,通过生理生化实验和16S rDNA序列分析将其鉴定到属分类阶元,构建系统发育树,进行系统发育分析。选择降解性能最好的Pseudomonas sp.LKY-5进行单因素实验,利用响应曲面法对培养条件进行优化。基于实验数据的多元回归拟合,建立二次多项式回归方程的预测模型,方差分析、残差分析和实验验证表明该预测模型可靠有效。显著性分析识别出底物浓度是影响降解效果的关键因素,当DBT浓度为100mg/L,温度为25℃~31℃,pH值为7.2~8.5,摇床转速为140rpm~180rpm范围内,7d可以基本完全降解。利用GC-MS对Pseudomonas sp.LKY-5的代谢中间产物进行分析和鉴定,推测其可能的代谢途径,发现菌株LKY-5同时具备两条完全矿化的代谢途径(扩展的“4S”途径和扩展的“Kodama”途径),具有较高的生物修复价值。以正十六烷、菲、芘和咔唑分别代表石油中其他组分(正构烷烃、多环芳烃和含氮杂环芳烃),考察菌株LKY-5对这些底物的降解能力,结果表明在单一体系中该菌株对这些底物均有降解效果,降解能力为正十六烷菲咔唑芘。在与DBT复合的双底物体系中,正十六烷、菲对DBT的降解呈促进作用,芘、咔唑呈抑制作用,而DBT对这些底物的降解均起抑制作用。通过对不同类型柴油的降解特性研究,发现Pseudomonas sp.LKY-5对其中各种硫化物均有不同程度的降解。基于DBT代谢中间产物中检测到一些长链烷烃和有机酸,推测Pseudomonas sp.LKY-5在降解过程中产生了生物表面活性剂。利用薄层色谱和HPLC-ESI-MS对该表面活性剂进行分析和鉴定,结果表明该表面活性剂为双鼠李糖脂(糖脂结构为Rha-Rha-C_8-C_(8:1)),另外还含有少量的游离脂肪酸(C_(18)、C_(18:1)、C_(19)、C_(19:1)、C_(20:1)、C_(20))。经过对该表面活性剂基本理化性质(临界胶束浓度、亲水亲油平衡值、乳化性能)的测定,以及稳定性能考察,表明该表面活性剂在高温、高pH、高盐度等极端环境下仍具有很好的表面活性。最后将Pseudomonas sp.LKY-5应用在DBT污染土壤的生物强化修复中,考察了污染强度、初始菌量、初始含水率、氮磷比、膨松剂用量对修复效果的影响,得到了最佳修复条件,为进一步实现含硫杂环芳烃污染土壤原位生物修复提供理论基础和技术支持。
【学位授予单位】：中国石油大学(华东)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X172
【图文】：

21LKY-13图 2-2 降解菌株的平板划线Fig.2-2 The results of plates streaking with degrading strains

第二章 含硫杂环芳烃降解菌的筛选、鉴定及培养条件优化降解菌株的分子鉴定及系统发育分析 细菌基因组 DNA 的提取及 PCR 扩增试剂盒提取得到的 5 株降解菌 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到了相图 2-3（a）中 1、2、3、4 和 5 泳道（分别表示 LKY-1、LKY-3、LKY-5、Y-13 菌株）所示，并且与分子标记 λ-EcoT14 digest DNAMarker 电泳条带（行对比，发现所获得的细菌 DNA 片段长度完全满足下一步 PCR 的要求。泳条带整体偏暗，含量较少，为了满足后续 16S rDNA 测序所需要的量， PCR 扩增，扩增得到的 PCR 产物电泳图如图 2-3（b）所示。从图 2-3（b 1、2、3、4 和 5 泳道在 Marker 1500bp 处有明显条带，阴性对照（-）没有出该 PCR 反应体系能够有效扩增出目标产物，并且在操作过程中没有造成

图 2-4 降解菌株的系统进化树Fig.2-4 The phylogenetic tree of DBT degrading bacterial strains.3.4 单因素对 DBT 降解率的影响筛选分离得到的 5 株单菌（LKY-1，LKY-3，LKY-5，LKY-6，LKY-13）对二吩均具有降解效果，选择降解效果最好的 LKY-5 菌株进行单因素实验，考察底物度、初始 pH 值、摇床转速和接种量对其降解率的影响。.3.4.1 底物浓度生物降解系统中同一种底物在其不同浓度条件下表现出的生物降解率是不同浓度太低不利于降解菌的存活和诱导产生降解酶系，浓度过高则会对微生物产生用，抑制底物的代谢，因此存在一个能够被有效降解的最适底物浓度[115,116]。不同度（20mg/L~600mg/L）对LKY-5降解率的影响如图2-5所示。当DBT浓度小于10，LKY-5 对 DBT 的降解率随着底物浓度的升高而升高，在 DBT 浓度为 100mg/

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本文编号：2801454