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微生物来源的氯代邻苯二酚1,2-双加氧酶基因在拟南芥中降解芳香族化合物的机理研究

发布时间:2020-08-24 10:03
【摘要】: 使用微生物来源的污染物降解相关基因改造植物,可以使植物获得降解污染物的能力而用于环境治理,这是一种有效的清除污染物的方法。芳香族化合物是现在工农业生产中产生的一类主要污染物。此类污染物具有化学性质稳定苯环结构,难以降解。在此项研究中,我们利用邻单胞杆菌来源的氯代邻苯二酚1,2双加氧酶基因tfdC改造拟南芥,探索植物降解芳香族污染物。氯代邻苯二酚1,2双加氧酶在微生物研究中已经被证实具有打开苯环的能力。本研究中获得的转基因植株在形态和生长状态上与野生型植株没有可见的差别。通过分析发现,tfdC转基因植株对芳香族化合物邻苯二酚的耐受性相对于对照植株有了显著的提高,并显示出显著提高的吸收和转化邻苯二酚的能力。HPLC分析结果进一步显示在植株内部检测到的邻苯二酚的代谢产物顺,顺-己二烯二酸的量远远少于预期应产生的量。据此,我们推测植物内部可能具有类似于细菌邻位降解途径中TfdC下游的TfdD和TfdE酶活性,使得降解产物顺,顺-己二烯二酸进一步被降解。利用生物信息学方法检索拟南芥基因组数据库,我们确实在植物中发现了TfdD和TfdE的同源蛋白,而没有发现TfdC的同源蛋白。可见,tfdC基因赋予转基因植物的TfdC酶活性在植物降解芳香族化合物过程中是至关重要的,也同时预示着细菌来源的基因在植物降解环境中芳香族污染物应用中的良好前景。 叶绿素酶(EC 3.1.1.14)催化叶绿素降解的第一步反应。叶绿素酶基因的克隆推动了对叶绿素酶生理生化特性的研究,也有助于揭示叶绿素酶在植物体内作用的机制。在拟南芥中有两个叶绿素酶基因,AtCLH1和AtCLH2。AtCLH1的相关研究报道比较多,关于其体内的功能也已有报道,而对AtCLH2的研究则相对较少。本研究中,我们在体外表达纯化了由AtCLH2编码的叶绿素酶2。叶绿素酶2在体外表现出了叶绿素酶的活性。我们还发现,与由AtCLH1编码的叶绿素酶1相比,叶绿素酶2在体外达到最大叶绿素酶活性需要更高浓度的去污剂(Triton X-100)或极性溶液(丙酮)。为了进一步研究AtCLH2在植物体内的功能,我们采用了RNA干扰的方法抑制了拟南芥中AtCLH2的表达。同野生型拟南芥相比,RNA干扰的转基因植株中叶绿素含量基本不变,而叶绿素酸酯含量则显著下降,使得叶绿素与叶绿素酸酯的比值显著升高。另外,我们还注意到AtCLH1和AtCLH2的表达谱有一定的差别。我们的结果显示AtCLH2在体内叶绿素代谢中可能扮演着一个不同于AtCLH1的角色。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:X172
【图文】:

二酸,二烯,邻苯二酚,植物毒性


邻苯二酚的平板上,一些野生型种子己经不能萌发或者萌发后即死亡。在 0.5mM邻苯二酚的平板上,所有野生型种子都不能萌发。而在含有 0.5mM顺,顺一己二烯二酸的平板上,野生型种子依然能发育出完整的植株(图1.3)。这就说明邻苯二酚和其代谢产物顺,顺一己二烯二酸具有明显的毒性差别,邻苯二酚对植物的毒性远远高于顺,顺一己二烯二酸。这种毒性的差别使我们可以用邻苯二酚作为衡量转基因拟南芥中侨尤基因是否具有功能的指示。同时,我们也注意到,高于 0.4mM的顺,顺一己二烯二酸对于植株的发育也有一定抑制作用,具体表现在对植株的根发育有抑制作用(图 1.3)。这说明高浓度的顺,顺一己二烯二酸对植株还是具有一定的毒性。

编码序列,转基因拟南芥,表达水平


图1.3邻苯二酚和顺,顺一己二烯二酸的植物毒性。Figure1.3Relativetoxieitiesofeateeholandeis,eis一mueonieacidtoArabidoPsis.野生型植株在含有0.1(左),0.2(中)和0.5mM(右)邻苯二酚或顺,顺一己二烯二酸的1/2MS培养基平板1生长两周后的形态观察同时,我们考察了27个T:代CT植系在含有0.1或02mM邻苯二酚的平板上的表型。研究结果显示,尽管几代植株还存在着遗传分离,几乎所有的CT植株还是展现比野生型更高的邻苯二酚耐受性。根据以上结果,我们选择了CTI一2,CTI一5,CTI一16和CTI一19四个CT株系用于进一步的研究。3.啊C基因在cT植株中的表达使用Rl’-pCR的方法,验证侨九)基因在T4代纯合转基因株系中的表达。内源的ACTjl基因作为内参。在所分析的四个CT株系中,都鉴定出一条大小800bP左右的对应于老斌了编码序列的条带,而在vT植株中则没有发现相应的信号。

邻苯二酚,耐受性,植株


图1.6在土壤中CT植株具有显著提高的邻苯二酚耐受性。Figure1.6EnhaneedeateeholtoleraneesofCTPlantsinsoil·A和B,杭株在含有1mM的PNS润湿的土壤中生长两周.随后撼三一天用、mM的邻笨二酚处理三周。C,以上处理「{,植株鲜重。数据通过t检验。**代表尸、0.01。D,E和F,植株在PNS润湿的土壤中生长两周戈D),随后i味三天”〕3mM的邻苯二酚处理止周(E),川水恢复三周(F)。这体现了CT植株对邻苯二酚较高的耐受性,这也有利于CT植株在植物降解邻苯二酚中的应用(图1.SA,B)。6.CT植株在土壤中的邻苯二酚抗性观察我们选取野生型和CTI一2株系在土壤中研究了邻苯二酚对于种子萌发和植株生长的影响。种子被播种在事先用0,l,2,或3mM邻苯一酚的州S培养基润湿过的土壤上,放置在培养室中培养。同野生型相比,CTI一2株系的萌发率更高。在植株萌发后,用含有O,1,2,或3mM的邻苯二酚的水进行喷洒处理。在一周过后,更多的CT植株存活下来。喷洒处理三周后,CTI一2植株展现

【共引文献】

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本文编号:2802317

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