嗜热螯台球菌产聚羟基脂肪酸酯的研究

发布时间：2020-08-26 13:50

【摘要】：聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物利用可再生资源如碳水化合物、脂肪酸等体内合成的一类生物聚酯，它不仅具有与传统化学合成高分子（如聚丙烯）相似的材料性质，而且是环境友好型可降解材料。另外，PHA还具有生物相容性、压电性、光学活性等特殊性质，并且是人工骨等医学材料的最佳原料之一。随着石油资源的日益枯竭，PHA的研究开发引起了越来越多的重视。相对于常温微生物，嗜热微生物在中温发酵生产PHA具有许多优良的性能，表现为：（1）中温条件下底物溶解度提高，酶催化反应速率快，可以有效提高细菌的生长速度和PHA产率；（2）中温条件下可以抑制杂菌的生成，保证嗜热产PHA微生物成为优势菌种，使发酵合成PHA系统更易稳定运行；（3）微生物发酵的自发产热可以维持嗜热微生物生长的适宜温度，无需额外的冷却与加热；（4）对嗜热微生物PHA合成相关酶及编码基因的耐热机制进行分析研究，可为PHA合成酶的定向进化提供理论参考，所分离的耐热PHA合成酶可应用于PHA的体外合成。然而目前发现能在中温条件下合成PHA的嗜热微生物仅有几种，且这些微生物的菌体浓度都较低，不具备工业化研发潜力。本课题组从脱氮生物滤塔中筛选到一株产PHA的嗜热螯台球菌TAD1，这是该菌首次被报道具有产PHA的能力，但是该菌的PHA含量较低，只有56.3%。因此本论文采用尼罗红琼脂平板法对螯台球菌进行筛选，获得高效积累PHA的优势菌株TAD1S，利用荧光显微镜观察PHA在细胞体内的积累情况，通过气相色谱、红外衍射光谱和核磁共振扫描等分析方法，检测螯台球菌所积累PHA的结构特征和材料特性，以及在细胞体内的含量；考察TAD1S细胞生长与PHA积累之间的联系，初步研究不同因素对TAD1S发酵产PHA的影响规律，探讨不同碳源在TAD1S体内的代谢途径和PHA转化效率；深入研究不同因素对TAD1S利用生物柴油副产物（甘油）发酵产PHA的影响规律，消除高浓度甘油对TAD1S生长的抑制，建立了基于甘油的发酵产PHA体系；采用5-l生物反应器研究发酵工艺对TAD1S发酵产PHA的特点，为扩大规模产PHA建立理论模型。在20g/L葡萄糖、45℃、180r/min下，TAD1S培养36h后，其生物量和PHA含量分别为2.71g/L和73.6%。通过多种分析手段，确定能合成短链聚羟基脂肪酸酯（scl-PHA），其中绝大部分为聚（3-羟基丁酸）（PHB）（99%）。 TAD1S利用葡萄糖发酵，发现PHB的积累与细胞生长同步进行，而无需严格的氮源限制。TAD1S在45-55℃范围内有好的PHB积累性能，即使温度高达60℃，TAD1S仍然可生长并积累PHB，说明TAD1S体内的PHB合成相关酶有好的热稳定性。随着碳氮摩尔比的升高，TAD1S的PHB含量均逐渐增大，然而，即使在高浓度的氮源环境下（C/N=5），TAD1S仍可积累一定浓度的PHB（55.7%），这说明TAD1S有好的抗高氮源浓度特性。总之，TAD1S利用葡萄糖发酵产PHB的最适条件为：发酵时间28h，发酵温度50℃，碳氮摩尔比30。此时生物量、PHB含量和PHB得率分别为4.50g/L、76.5%和3.44g/L。另外，TAD1S还可利用大部分短链脂肪酸钠盐（C2-C6）来产PHB，说明TAD1S体内的PHA合成途径是scl-PHA合成途径；TAD1S可以在中温环境下直接利用淀粉进行生长，而无需水解预处理。通常绝大部分基于甘油产PHA的微生物都是常温微生物，而TAD1S在中温条件下可以利用甘油发酵产PHB，在最适条件下，TAD1S的生物量、PHB含量和PHB得率可达8.12g/L，80.8%和6.56g/L，此时底物转化率和PHB时空产率分别为0.33和0.21g/L/h。采用5-l生物反应器进行扩大培养研究，探讨TAD1S利用甘油产PHB的规律。采用分段补料发酵方法，在发酵后期进行限氮控制，可有效提升PHB得率，减少下游分离纯化工艺成本。发酵40h后得到最大PHB含量68.3%，此时生物量、PHB得率、底物转化率和时空产率分别为25.4g/L、17.4g/L、0.26和0.434g/L/h，说明限氮控制可以有效提高TAD1S体内的PHB含量。该中温工艺与其它常温工艺相比，培养时间减少，而底物转化率和PHB时空产率却显著增大，展现优越的发酵性能与应用前景。另外，我们采用尼罗红琼脂平板法从TAD1S的来源（脱氮生物滤塔的生物膜）进行筛选，获得一株生长良好且积累PHA的新菌株-K5。经系列检测分析，发现该菌合成的PHA主要也是PHB，说明K5体内的PHA合成途径也是scl-PHA合成途径，该过程最适温度和初始pH分别为45℃和7.0。本研究初步阐明了TAD1S和K5在中温条件下利用不同碳源发酵产PHA的特征与规律，为后续菌株改造，大规模扩大培养提供了理论依据。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ920.1;X172

【参考文献】