百菌清降解菌株的分离、鉴定，水解脱氯酶的基因克

发布时间：2020-08-27 16:31

【摘要】：百菌清是一种广谱氯代芳香族杀真菌剂,是美国第二大类农业杀真菌剂,年使用量为5000吨,而我国百菌清年产量超过了8000吨。百菌清对于鱼、鸟和水生无脊椎动物具有高毒性,并且在生态系统中被广泛检测到,其造成的污染已经引起了广泛的关注。百菌清污染的生物修复被认为是一种有效、可靠和无二次污染的方法。因此,筛选高效降解百菌清的微生物菌种资源,探索其降解百菌清的作用机理,充分发挥其降解能力,具有重要的理论意义和应用价值。本研究的意义在于分离、筛选高效百菌清降解菌株,并对菌株在不同环境条件下降解百菌清的特性进行研究,以期为百菌清污染环境的修复提供科学依据；同时克隆百菌清的降解关键酶基因,进一步研究降解酶的特性、催化机制等,阐明氯代芳香族化合物的水解脱氯新机制。本文通过富集培养的方法,从百菌清污染的水样和土壤中分离到15株百菌清降解菌株,分别命名为CTN-1～CTN-15。对这15株百菌清降解菌株进行系统发育分析、染色体ERIC-PCR指纹图谱分析,结果显示这15株菌具有丰富的多样性。经生理生化鉴定和系统发育分析,15株菌株分别被鉴定为Ochrobactrum sp., Pseudoxanthomonas sp., Bordetella sp., Shinella sp., Caulobacter sp., Rhizobium sp., Pseudomonas　sp.和Lysobacter sp等八个不同的属。根据细胞壁脂肪酸成份、极性酯、醌、G+C mol%、DNA-DNA杂交、生理生化、16S rRNA基因系统发育分析等,将Lysobacter sp. CTN-1鉴定为Lysobacter属中的一个新种,命名为瑞身溶球菌Lysobacter ruishenii sp. nov. CTN-1T(=DSM 22393T=CGMCC 1.10136T)。随机选取分属于不同属的8株百菌清降解菌株,比较了菌株对百菌清的降解能力,结果显示8株菌对百菌清的降解能力有很大差异,尤其是降解速率,从4-40 mg·1-1·d-1不等,分离自水样的5株菌的降解能力明显优于土壤中的3株菌。菌株CTN-3和CTN-14在液体培养基中降解速率最快,12 h几乎完全转化20 mg·1-1的百菌清。百菌清代谢途径研究表明15株菌降解百菌清的产物均为羟基百菌清。该研究结果为百菌清污染环境的生物修复提供了丰富的菌种资源。采用SDS高盐结合CTAB法从百菌清降解菌株Pseudomonas sp. CTN-3中提取高质量的染色体总DNA,用鸟枪法构建了总DNA的基因组文库。从大约15,000个转化子中筛选到2个具有百菌清脱氯活性的阳性克隆子1-10和2-1。用软件分析及亚克隆的方法,确定了编码百菌清脱氯酶(Chd)的1026 bp长结构基因chd,通过chd基因序列的Blast比对,发现在基因水平上无任何同源序列；在氨基酸水平上,发现其具有金属β-内酰胺酶超家族的一个假定保守区,并且与一些金属水解酶最高同源性也只有29%。例如,与来自Streptomyces coelicolor的环化酶具有29%%的同源性,与来自Stackebrandtia nassauensis依赖于锌的水解酶具有27%的同源性,与来自Candidatus Koribacter versatilis类-β-内酰胺酶具有24%的同源性。可见,克隆到的chd是一个全新的百菌清水解脱氯酶基因。二级结构预测显示Chd具有金属β-内酰胺酶的折叠特征,为p-折叠核心区被α-螺旋包围的αβ/βα三明治折叠。而且,在Chd中也发现金属p-内酰胺酶最典型的特征标签His-X-His-X-Asp-His,有意思的是,第一个氨基酸是Ser而不是His。显示该酶是报道的第一个来源于金属β-内酰胺酶超家族的水解脱氯酶。根据确定的ORF,设计特异性引物,成功的从十五株降解菌株的基因组序列中扩增到百菌清水解脱氯酶结构基因,研究发现该结构基因大小从1002到1026 bp不等,十五株百菌清农药降解菌中的百菌清水解脱氯酶编码基因共有48处碱基位点有变化,其各亚型之间的同源性为99%左右。将百菌清脱氯酶结构基因连接到表达载体pET29a上,在E.coli BL21中实现了高效表达。通过MS/MS、NMR等多种方法进一步鉴定Chd转化百菌清的产物为4-羟基百菌清,并且证明Chd能在厌氧条件下进行百菌清的脱氯,表明Chd是一个水解脱氯酶而不是氧化酶,从而将Chd定义为一个新的氯代芳香族化合物的水解脱氯酶(EC3.8.1.12)。对百菌清水解脱氯酶的酶学特性进行了研究。建立了Chd的酶学反应体系：50 mMPBS (pH7.0),0.2mM百菌清,反应酶量50μl,50℃反应10 min,用3 ml二氯甲烷中止反应,立即测定OD232值。酶活力单位(U)定义为：在pH 7.0,温度50℃条件下,每分钟催化减少1μmol百菌清所需的酶量。Chd酶学特性研究显示,30℃到70℃,温度对酶活力的影响不大,其最适反应温度为50℃,从30℃开始至40℃相对活力仅下降12%,50℃时处理10 min,相对酶活下降不足5%,而处理1h后,相对酶活下降至18%,50℃到70℃的范围内,相对酶活迅速下降,60℃时基本失活。在pH为7.0时酶活力最高,在pH 6到pH 9的范围内Chd比较稳定,缓冲液中处理30 min后Chd的相对酶活力仍保持95%以上。稳定性在pH 7.0时最高。1.0mM Ag+、Al3、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+; 10 mM表面活性剂SDS; 1 mM离子络合剂1,10-邻二氮杂菲；1 mM NBS,0.5mM DEPC强烈抑制了百菌清水解脱氯酶Chd的活性。1.0mM Cr3+、Co2+、Cu2+; 10mM Tween 80、Triton X-100、pCMB、PMSF、PAO和PGO对Chd有较强的抑制作用。而1 mM Zn2+, Ca2+, Ni2+, Mg2+, Li+、Ba2+; 10 mM金属螯合剂EDTA对Chd仅有程度轻微的抑制(抑制作用小于10%)。 Chd水解百菌清的Km为0.112 mM, kcat值是207s-1,在最佳反应条件下的催化效率值为1.8土106 M-1·s-1,这些数据表明百菌清是Chd的良好底物。Chd的等电点约为4.13。Chd在自然状态下的分子量为33,886 Da,和单体酶的理论计算值基本一致,说明Chd可能是一个单体酶。对Chd催化百菌清脱氯的机制进行了初步研究。Chd能被1,10-邻二氮杂菲完全抑制,而随后补加Zn2+能恢复活力,证明Chd是一个金属酶。Chd能被DEPC完全抑制,羟胺处理后恢复活力,说明Chd活性位点存在组氨酸残基。Chd能被NBS完全抑制,但用4-羟基百菌清预处理后能防止Chd被NBS抑制,说明Chd活性位点存在色氨酸残基。通过对Chd催化活性位点的定点突变,初步研究了Chd可能的催化机制。与未突变的野生型Chd相比较,突变体H38Q、H271Q、H326Q、D67A、D215A、D244A、D264A、D323A、C25A、W219F、W227F、W282F、W324F、H283Q、S81T、T150、和E203V对酶活力没有显著影响,突变体H63Q和D337A对酶活力有部分影响(30%-50%),而突变体H128Q、H157Q、D45A、D130A、D184A、W241F、S126H和G208A的脱氯活力则完全消失,表明这些位点对酶的催化活性非常关键。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X172;X592
【图文】：

脱卤反应,微生物,脱卤作用

图2一1微生物中已报道的脱卤反应F19.2一1RecentlyexPloreddehalogenationreaetionsinbacterialeultureslogenationof，l，2一dibromoethane，byahaloalkanedehalogenase(DhaAO(PoelarendsetanationofehloroaeetatebyagrouP11dehalogenase(L一DEXorDhlB)(Hilletal.1999).(e)rohydroquinoneduringPentaehloroPhenolmetabolismbytetraehlorohydroquinonedandarajahetal.1999).(d)Initialdehalogenationstepsduringthemetabolismoflindanewodehydrohalogenationsarefollowedbytwoh)，drolytiestePs.(e)Reduetionoftriehlordehalogenase(TRI))(Magnusonetal.2000).(0Theaetivityofortho一ehloroPhennase(CIU〕)(SmidtHetal.2000).化合物微生物降解过程中的关键步骤实际上就是脱卤作用。在这或轻基基团取代化合物的卤原子。去除卤原子不仅可以减小卤代化，而且可以避免后续代谢过程中形成有毒的中间代谢产物的可转化卤代化合物过程中，其由于亲电性而形成酞卤化合物或2一卤成细胞损伤。从目前的研究来看，微生物脱卤研究主要在厌氧和

反式,互变异构酶,二氯丙烯,氯代

像4一氯苯甲酞一coA脱卤酶一样，3一氯一丙烯酸也从spZ杂化的碳原子上取代卤原子。从尸 seudomonaspavonaceao170中获得的顺式和反式3一氯代丙烯酸脱卤酶在1，3-二氯丙烯代谢过程中起到重要作用，其在农业上用于去除线虫等植物病害(图2一14c)。反式一1，3一二氯丙烯通过卤代烷脱卤酶转化之后，产物反式一1一氯一3一轻基丙烯醇氧化而产生反式一3一氯代丙酸酷。CaaD将这个产物转化为丙二酸半醛、氯离子和质子。接着，丙二酸半醛脱梭反应产生乙醛，其可用于一种可替代的生长基质。最近，x光结构分析已解决了CaaD酶的自然和无活性的两种形式 (deJongetal.2003)。该酶是由叩异二聚体而形成的三聚体(图2一 18a，b)。它的折叠相似于4一草酞巴豆酷互变异构体(4一OT)，其属于互变异构酶超家族中的一员，包括异构酶和互变异构酶 (Whitman2002)。但是

百菌清,紫外扫描,降解效果,富集

叫CTNc。二etAf妞。《。grb图1一2百菌清的浓度与吸光度的相关曲线Fig.l一 2Curveofrelativityofehlorothalonileoneentrationandabsorbeney2.2降解菌株的菌落形态及生理生化特征所分离降解菌的菌落、菌体形态和生理生化指标总结于表1一1菌清平板上形成透明圈(如图1一3)。从表1一1中可知，所分离的;降解菌株能在百巧株降解菌都为革兰氏阴性菌，这说明本研究所取污染样品中，革兰氏阴性降解菌是占主要优势的。这些菌株的生理生化等特征存在差异，表明具有一定的多样性。

【参考文献】