高灵敏纳米生物传感体系构建及在环境检测中的应用

发布时间：2020-09-02 18:43

　　随着环境污染问题的日益突出,人们对污染物检测和监管提出了更高的要求,发展新的、灵敏、可靠的检测方法具有十分重要的意义。本论文主要从降低检测背景和增强检测信号两个方面对提高检测方法的灵敏度进行了研究,基于不同的新型材料构建了一系列新的生物传感方法,并将其应用于环境污染物、环境微生物等检测。本论文包括的主要内容如下:(1)以氧化石墨烯为反应平台,提出了一种基于分子信标向G-四链体构型转换,继而引发核酸杂交连锁反应的高灵敏Pb~(2+)检测方法。作者设计了两段分子信标探针H1和H2,H1的一端为富含鸟嘌呤(G)的序列,并且“茎”部分有一个碱基错配。当不存在Pb~(2+)时,由于石墨烯对探针单链部分具有强烈的吸附作用,H1和H2吸附在石墨烯表面。当Pb~(2+)存在时,H1分子信标被打开,富含G碱基的一端与Pb~(2+)形成G-四链体结构,另一端暴露出来的单链序列启动核酸杂交连锁反应,不断有分子信标被打开,最终形成超长的双链结构。因为石墨烯对双链DNA的吸附作用较小,双链探针从石墨烯表面脱离,荧光得到恢复。由于石墨烯超强的荧光猝灭效率以及核酸杂交连锁反应的放大作用,该方法实现了对Pb~(2+)的高灵敏检测,最低检出限为0.61 nM。另外,该方法操作简单,选择性好,灵敏度高,并且适用于实际水样中Pb~(2+)的检测。(第2章)(2)基于磁性Fe_3O_4和核酸杂交连锁反应,通过构建一种超串联探针信号放大模式,实现了对Hg~(2+)的高灵敏检测。该方法中应用了三段核酸探针:H1和H2的一端是富含胸腺嘧啶(T)的序列,H2与H3部分碱基互补配对。当待测体系中含有Hg~(2+)时,H1和H2之间通过T-Hg~(2+)-T错配形成双链,进而引发核酸杂交连锁反应,H2和H3的分子信标结构不断被打开,形成超串联核酸探针,从而达到放大荧光信号的目的。该方法的检出限为0.36 nM,能够满足世界卫生组织(WHO)对饮用水质监测标准的要求(10 nM)。在本方法中,磁性Fe_3O_4作为反应平台和分离介质,将检测目标和信号探针从检测介质中分离出来,有效地降低了其他离子的干扰,使得该方法具有良好的选择性,并且能成功地应用到实际样品的检测中。(第3章)(3)利用磁性石墨烯对ssDNA的选择性吸附能力和磁性分离能力,提出了一种先捕获、富集,后检测的Hg~(2+)定量测定方法。该检测体系包含H1和H2两段核酸探针。探针H1具有两个功能,富含T碱基的序列可以捕获Hg~(2+),其他序列可以通过吸附将整个探针固定在磁性石墨烯表面。当溶液中的Hg~(2+)被H1探针捕获到磁性石墨烯表面,并且通过磁性分离和富集之后,加入释放序列H2,使得H1和H2形成完整的双链结构,进而从石墨烯表面脱离,释放出荧光。在最佳实验条件下,经过5倍富集,该方法的最低检出限为1.54 nM。该方法检测范围宽,灵敏度高,操作简单,能够较好地应用于环境水样的检测。(第4章)(4)提出了一种基于纳米金和核酸杂交连锁反应的高灵敏比色方法用于检测水体中的Hg~(2+)。当反应体系中不含Hg~(2+)时,H1、H2的单链部分吸附在纳米金表面,使金纳米粒子在高浓度盐溶液中稳定存在;而当Hg~(2+)存在时,H1的分子信标结构能够在Helper探针的辅助下被打开,继而引发核酸杂交连锁反应,使分子信标不断被打开形成双链结构。由于失去单链的保护作用,金纳米粒子在高浓度盐溶液中发生团聚,颜色由红色变为蓝色。该方法操作简单,只需将几种试剂混合检测即可,并且具有高灵敏度,高选择性的优点,适用于实际水体中Hg~(2+)的检测。(第5章)(5)基于非标记纳米金粒子的泄漏过程,提出了一种荧光能量共振转移法,实现了环境水体中盐酸的选择性定量检测。纳米金的最大吸收波长在520 nm左右,与荧光素的荧光发射波长一致,所以纳米金通过荧光能量共振转移能有效地猝灭荧光素的荧光。当存在盐酸时,纳米金的数量和表面形态发生改变,引起纳米金吸光度降低,进而导致荧光强度升高。通过测定荧光强度,可以十分灵敏地实现盐酸浓度的检测。实验表明,该方法在30 min内即可完成检测,最低检出限为0.6μM。由于金化学性质稳定,其他离子的存在以及一般微小的环境变化对纳米金的表面形态影响不大,所以该方法具有良好的选择性。(第6章)(6)建立了一种基于铕配合物的时间分辨荧光传感方法,实现了对水处理工艺中重要的功能菌——氨氧化细菌的定量检测。铕配合物是一种长寿命发光材料,在时间分辨模式下可以有效降低生物基质的背景荧光,提高检测方法的灵敏度。根据氨氧化细菌特异性序列,设计得到了两段功能探针:末端修饰氨基的捕获探针与目标序列的一部分碱基互补,并且通过戊二醛的交联作用可以固定在氨基硅烷化的普通玻璃片表面;标记铕配合物的信号探针与目标DNA的另外一段碱基互补。当存在目标DNA时,捕获探针和信号探针分别与目标DNA杂交,形成串联结构,进而将信号探针固定在玻璃片表面。通过测定铕配合物的时间分辨荧光强度可以定量检测目标DNA和氨氧化细菌的数量。该方法灵敏度高,对常见大肠杆菌、多粘芽孢杆菌以及维氏硝化杆菌等细菌具有优异的选择性,并且能成功应用于实际污泥样品的检测。(第7章)(7)基于长寿命量子点和葡萄糖氧化酶,建立了一种灵敏的非标记方法检测血清中的葡萄糖。葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下产生的过氧化氢对量子点具有猝灭作用,因此量子点可以用于葡萄糖的定量检测。但是由于过氧化氢对量子点荧光的猝灭效率不高,所以基于该原理的检测方法灵敏度较低。通过向该检测体系中引入对苯二胺,设计了一种更灵敏的葡萄糖检测方法。对苯二胺在过氧化氢的氧化作用下产生的复杂化合物对量子点的荧光具有更高的猝灭效率,从而提高了检测方法的灵敏度。另外,以长寿命量子点为荧光指示剂,在时间分辨荧光模式下能有效去除生物基质中的背景荧光,降低干扰,使该方法在应用性实验中取得了较好的效果。该方法不需要繁琐的材料标记和酶固定,操作简单,灵敏度高,并且具有优异的选择性,可以成功的应用于血清中葡萄糖的检测。(第8章)
【学位单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X832
【部分图文】：

原理图,荧光材料,长寿命,背景值

图 1.1 长寿命荧光材料降低检测背景值的原理1.1 Schematic of background signal reduction using long-life time fluorescence m 稀土金属配合物土元素包括 15 种镧系元素以及另外的 Sc 和 Y 两种元素。在稀土元结构中，4f 层电子没有充满，因此能产生多种不同的电子能级。稀荧光强度很弱，难以满足在分析中的应用要求，但是当与某些有机形成稀土金属配合物时，配体与稀土离子之间发生能量转移，其荧高[40-42]。在此过程中，配体吸收能量转移给稀土离子，因此吸收波，而发射波长由稀土离子的种类决定。然而，并非所有的稀土离子能发射很强的荧光，根据已有研究，Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+四种量子产率高，荧光强度强[43~45]。稀土配合物与普通的荧光染料相比势：（1）荧光寿命长。稀土配合物的荧光通过三重能态能量转移产需要一定的延迟时间，所以稀土配合物的荧光寿命远远长于普通荧光合物为例，配体与 Eu3+之间的能量转移如图 1.2 所示。稀土配合物

铕配合物,发光原理

图 1.2 铕配合物的发光原理Figure 1.2 Emission mechanism of europium complex于上述优点，基于稀土配合物的时间分辨荧光法已广泛应用于核酸命大分子以及金属离子的检测。早在 1975 年，Smith 就已经提出“”的概念，合成了一种铕配合物，并进行了初步的应用[46]。在 198i 等用铕配合物作为荧光标记物建立了一种检测乙肝病毒的免疫分析时间分辨荧光来降低荧光背景值的思路，开启了时间分辨荧光免疫[47]。Yuan 等用 BHHCT Eu3+做为标记物研究比较了竞争免疫和非实了竞争免疫可以提高检测的灵敏度和精确度，此研究中建立的时疫方法比放射免疫法和酶联免疫法灵敏度高 10～100 倍[48]。有研究子与配体之间能量转移的发光原理，将配体和配合物中心离子分别探针上，建立了均相核酸杂交分析方法[49]。除了作为分析方法的标究将稀土配合物作为标记物应用于抗体的筛选[50]。3 量子点

吸收光谱,生物传感,量子点,共振转移

3. 量子点在生物传感中的应用量子点一般作为荧光标记物应用在生物分析方法中，通过检测生物分子识别过程中的荧光变化来实现靶标分子的检测。这些方法一般通过三种途径实现分子识别过程中荧光信号的响应，一种是量子点与有机染料之间的荧光能量共振转移，荧光能量共振转移法是最常见的方法，在分子识别过程中量子点和有机染料的距离减小，量子点和有机染料之间就会发生荧光能量共振转移[75-77]。以三明治杂交模式为例，如图 1.3（A）所示，检测体系包含两条 DNA 探针，一条标记在量子点表面，另外一条末端标记有机染料，如果目标 DNA 存在，则可以同时与连接量子点和有机染料的探针杂交，使量子点和荧光基团之间的距离减小，发生荧光能量共振转移。该方法的优点是灵敏度高，并且目标序列无需标记，缺点是只适用于短链序列的检测[78]。有研究者在以上反应模式的基础上，利用量子点吸收光谱宽、发射光谱窄等优点建立了多通道的分析方法，通过两种不同的荧光基团与量子点之间的荧光能量转移，实现两种不同目标物的检测[79]。同样的，在分子信标的两端标记量子点和荧光基团，也可以在分子信标构型的转变中实现荧光能量共振转移的开关[80]。

【相似文献】