海滩植物海马齿Sesuvium portulacastrum L.抗汞机制的初步研究及相关基因分离鉴定

发布时间：2020-09-04 20:11

　　工业发展的大爆发,往往伴随着环境严重污染的沉重代价。随着世界工业尤其是采矿业、冶炼业、印染业、电镀业等的迅速发展以及农药、化肥的大量使用,严重地污染了土壤、水质和空气,其中土壤中的重金属(Hg、Cd、As、Cu和Al)污染尤为严重。汞是一种极毒的重金属元素,其毒性位于各金属之首。汞是植物的非必需元素,对植物生长和发育毒性显著,当植物体中的汞积累到一定程度后,会通过不同的途径干扰和破坏细胞正常的代谢过程,导致植物生长异常直至死亡；同时汞通过植物进入食物链富集后会危害动物及人体健康。植物在漫长的进化过程中,形成了一系列潜在的机制,间接或直接的参与重金属毒害的解除或适应于重金属胁迫的环境,涉及形态、生理、发育、分子细胞等各个层次的复杂的生物学过程。盐生植物海马齿(Sesuvium portulacastrun)属番杏科(Aizoaceae)海马齿属(Sesuvium),草本或亚灌木植物,分布于热带和亚热带海岸的沙滩上。我们实验室前期研究发现海马齿不仅能适应高浓度的盐环境而且能吸附积累大量的Hg2+。在本研究中,从蛋白质组学、基因差异,结合相应的植物形态、结构和生理变化对海马齿耐汞性机理进行了初步的研究；同时通过分子生物学方法从海马齿植物中分离了三个与耐汞相关的新基因,并对它们在微生物和拟南芥植物中进行了功能分析,结果如下： 1、利用双向电泳技术,获得无Hg2+胁迫下和Hg2+下的海马齿总蛋白点1019个,上调或下调2倍以上的蛋白点有116个,汞胁迫下新出现的蛋白点99个。 2、本研究挑选上调或下调2倍以上,或新的蛋白点46个,其中上调3倍以上为35个,下调2倍以上为5个,在Hg2+胁迫下新出现的蛋白点6个进行一级和二级质谱分析。通过质谱分析,其中19个蛋白点被鉴定出来,这些蛋白点按功能分类,可分为6类：(Ⅰ)光合作用相关蛋白,占42%；(Ⅱ)能量代谢蛋白,占26%；(Ⅲ)氨基酸代谢蛋白,占11%；(Ⅳ)核苷酸代谢蛋白,占11%；(Ⅴ)响应逆境胁迫和防御相关蛋白,占5%；(Ⅵ)未知功能和假想蛋白,占5%。 3、结合蛋白质组学分析的结果,利用分子生物学手段,对海马齿中4个基因进行了全长cDNA序列克隆,得到了其中3个基因的全长序列并登陆,它们分别为金属硫蛋白基因(SpMT),GenBank登录号：JN185440；谷氨酰胺合成酶基因(SpGS)GenBank登录号：JQ425085；叶绿体ATP酶α亚基基因(SpF-ATP-α)GenBank登录号：JN192444;及一个基因的部分序列,叶绿体ATP合酶β亚基基因(F-ATP-β),并对三个全长基因进行了生物信息学分析。 4、利用实时荧光定量PCR技术,分析了三个全长基因组织特异性表达情况及对汞离子胁迫的响应。结果表明：三个基因均主要在叶片中表达,叶中的表达量明显高于根与茎中的表达量。在含汞的环境下,SpMT与SpF-ATP-α基因明显响应Hg2+胁迫,其表达量随Hg2+的增高和胁迫时间的增长而增高。SpGS基因在低浓度汞处理时其表达量升高,高浓度Hg2+胁迫下SpGS基因表达被抑制,但是随着胁迫时间的增长,无论是在高浓度还是低浓度汞胁迫下SpGS基因表达量均有上升的趋势。 5、构建了SpMT、SpGS、SpF-ATP-α三个基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达。根据金属硫蛋白的特殊性质,构建了三个含有不同分子伴侣的SpMT基因原核表达载体,分析了不同的分子伴侣对金属硫蛋白基因在原核中表达的影响,发现带SUMO分子伴侣的P-Cold-sumo载体最适合表达金属硫蛋白。构建了带SUMO分子伴侣的SpGS、SpF-ATP-α P-Cold-sumo载体,并分析了它们在微生物中的表达情况,结果表明SpGS、SpF-ATP-α基因均能成功表达。 6、SpMT、SpGS、SpF-ATP-α在大肠杆菌Ecoli Top10中表达,SpMT能明显提高E.coliTop10的耐汞能力,而转SpGS基因的EcoliTop10具有轻微的耐汞性,SpF-ATP-α则不能提高大肠杆菌Ecoli Top10的耐汞能力。 7、构建了SpMT基因植物表达载体pVKH-35s-SpMT并成功转化模式植物拟南芥,耐汞性分析表明：SpMT基因能明显提高拟南芥对汞的耐受性,植物表现为：在含有浓度为5μ mol/L及10μmol/L HgCl2的培养基中能正常生长,生物量、叶绿素含量、根的数目及长度明显高于对照。 8、与GFP基因融合,构建了pCAMBIA-1304-35s-SpMT植物表达载体,并将其在洋葱表皮细胞中表达。亚细胞定位表明：SpMT基因主要为核表达,膜上有微量的表达。 9、测定了不同浓度和不同时间汞胁迫下,海马齿谷氨酰胺合成酶与叶绿体ATP合酶活性变化的情况,结果表明,ATP合酶活性在汞胁迫环境下随着时间的增长和浓度的增高而增高,海马齿谷氨酰胺合成酶活性在低浓度汞胁迫环境下随着时间的增长和浓度的增高而增高,高浓度汞胁迫环境下,其活性出现先被抑制,一段时间后再升高的趋势。 10、通过透射电镜观察发现,Hg2+对海马齿叶片的伤害主要表现为：1)细胞膜不断向胞内形成膜突起再形成空泡；2)随着Hg2+浓度不断升高,其叶绿体数目不断减少,体积变大,形状由椭圆型变成长型；3)类囊体基粒片层变得模糊不清；4)线粒体数目由少变多,形状由棒状变成圆形及椭圆型,线粒体双层膜结构与嵴变得模糊不清；5)细胞核核仁由一个变成多个,最后消失。 11、通过扫描电镜观察发现：1)在Hg2+胁迫下,海马齿根的表面结构变得散乱,而无Hg2+的海马齿根的表面结构紧凑有序;2)Hg2+迫下叶片表面的气孔数目较多,大多数呈闭合状态,保卫细胞大而饱满成半圆形,冷冻干燥后叶片表面无皱褶；而非汞胁迫下,叶片表面的气孔数目较少,保持开放状态,保卫细胞为长条形,冷冻干燥后叶片皱褶的厉害；3)在非Hg2+下海马齿茎横切面的导管成规则状排列,导管壁较薄,而在Hg2+胁迫下导管变大、成不规则状排列,导管壁厚,壁上多了很多内含物。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：X173
【部分图文】：

自然环境

(引用 BarkayT 等 2003)图1自然环境中的录循环Fig. 1 The mercury cycle in natural environment

迅速发展,材料

世界上最主要的汞排放属商年的汞排触且(陶年)

海滩植物海马齿Sesuvium portulacastrum L.抗汞机制的初步研究及相关基因分离鉴定

匕.操获升随洲田

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