高效铬还原菌Bacillus cereus SJ1和Lysinibacillus fusiformis ZC1的铬还原特

发布时间：2020-09-08 08:16

　　铬及其化合物广泛应用于电镀、制革、纺织、防腐等工业生产,随后工业废水废渣的肆意排放造成了环境的严重污染。利用具有铬抗性及还原性的微生物把高毒的铬(Ⅵ)转化为低毒的铬(Ⅲ)为铬解毒及生物降解提供了一个经济有效的污染治理手段。然而目前高效的铬(Ⅵ)还原菌很少,而且关于微生物铬抗性及还原性相关基因功能的认识也很有限。我们从电镀废水中分离了两株铬(Ⅵ)高抗还原菌,Bacillus cereus SJ1和Lysinibacillus fusiformis ZC1,并对其进行了铬(Ⅵ)还原特性的研究。SJ1和ZC1菌的铬(Ⅵ)最小抑制浓度(MIC)分别为30 mM和60mM。SJ1的铬(Ⅵ)抗性为诱导性表达,而ZC1菌的铬(Ⅵ)抗性为组成型表达。1 mM的K2Cr04被B. cereus SJ1还原需57小时,而被L. fusiformis ZC1还原只需12小时。对SJ1全基因组分析发现,B. cereus SJ1中含有一个铬转运操纵子chrIA1,两个铬转运相关基因chrA。除此之外,一个编码偶氮还原酶(azoreductase)的基因azoR和四个编码硝基还原酶(nitroreductase)的基因nitR也在其基因组中,这些基因都可能与铬还原相关。通过RT-PCR发现,相邻的两个基因chrIA1的表达都受到铬(Ⅵ)的诱导,而另外两个chrA则为组成型表达。铬还原相关基因无论是从基因水平还是从表型上都是组成型表达。chrIA1基因上游出现的编码解离酶(resolvase)的基因,下游的砷抗性相关操纵子以及编码Tn7类的转运蛋白ABBCCCD预示了B. cereusSJ1基因水平转移的发生。这种基因水平转移可能有利于菌体对铬污染环境的适应。本研究发现chrA1有一个受到铬(Ⅵ)调控的蛋白基因chrI。通过与基因文库中多种类似的且与铬转运基因chrA形成一个操纵子的调控子Chrl进行比对发现,两种氨基酸,赖氨酸(K)和精氨酸(R),在所有比对的序列中高度保守。这两种氨基酸生理学条件下带正电荷,很有可能是带负电荷的Cr042-基团识别和结合的位点。虽然Chrl的功能没有得到证实,但Chrl是首次提出的与铬(Ⅵ)还原调控相关的潜在调控子。 L. fusiformis ZC1是至今为止已经报道的铬(Ⅵ)还原效率最高的细菌。L.fusiformis ZC1的铬(Ⅵ)还原效率受到乙酸钠和NADH促进。ZC1还具有多种重(类)金属抗性。全基因组分析发现,ZC1菌含有多种预定的铬抗性基因、铬还原基因和(类)金属抗性基因。无论是从表型上还是从基因水平L. fusiformis ZC1的铬抗性都是组成型表达。此外,可能与铬还原相关的两个基因nitR和yieF也为组成型表达。其高效的铬还原效率很有可能归因于大量NADH依赖性的铬还原酶通过组成型表达的解毒作用,从而使得该菌能在如此恶劣的环境下代谢并存活。本论文的研究结果在铬(Ⅵ)抗性及还原性细菌资源的开发、细菌铬(Ⅵ)原性特性、细菌铬(Ⅵ)抗性调控和环境适应性的分子基础等方面都具有一定的理论价值和创新性。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：X172
【部分图文】：

示意图,抗性机制,细菌细胞,毒性

图1.1细菌细胞铬转运，毒性及抗性机制示意图(Raml‘rez一nl‘azeta一，2005)(A)铬酸根离子通过染色体编码的硫酸盐离子通道进入细胞;(B)细胞外的铬(vl)还原;(C)细胞内的铬(VD还原，随之产生的氧化压力可能导致细胞内部蛋白及DNA的损伤;(功细胞本身的代谢产物以及一些解毒酶会降低细胞内的氧化压力，减少铬(vl)离子对细胞的毒害作用;(E)质粒编码的转运蛋白能把铬(Vl)泵出细胞质外;(F)细胞本身的DNA修复系统能够保护细胞免受铬(VI)离子毒害作用。Fig1.1MeehanismsofehromatetransPort，toxieityandresistanceinbacterialeells(Raml‘rez一DI‘azetal.，2008)(A)Chromateenterstotheeellusingchromosolne一eneodedsulfateuPtakePathway.(B)ExtraeellularreductionofCr(Vl)toCr(111).(C)IntraeellularCr(Vl)reduetioneangenerateoxidativestressandthedamageofProteinandDNA.(D)Detoxifyingenzyl二esareinvolvedinProteetionfromtheoxidativestress，whiehminimizethetoxieeffeetsofchromate.(E)Plasmid一eneodedtransPorterseffiux

路线图,路线,抗性,还原菌

从铬(Vl)还原菌的鉴定;重金属的抗性;铬(Vl)抗性及还原性特性;全基因组分析;基因表达，影响铬还原的不同因素以及它们之间的相关性等方面着手，对两株菌进行了较详细的研究。研究的技术路线见图1.2。铬铬(V1)抗性及还原菌的筛选选菌菌株的鉴定定定铬(V1)抗性及还原性性性全基因组鸟枪测序及分析析析铬还原影响因素素基基因表达及共转录分析析析重金属的抗性性 {{{{{田田田田家家家生生生抗未未未抗经经经铬铬铬铬铬铬重重重抗抗抗不不不不不落落落落仍仍仍理理理性经经经性过过过抗抗抗还还还金金金性性性同同同同同形形形形霎霎霎生生生及铬铬铬及铬铬铬J陕陕陕原原原属属属基基基起起起碳碳态态态态基基基化化化还诱诱诱还诱诱诱相相相相相相抗抗抗因因因始始始源源学学学学因因因鉴鉴鉴原导导导原导导导关关关关关关性性性分分分细细细细鉴鉴鉴鉴比比比定定定性时时时性时时时基基基基基基钡lJJJJJ析析析胞胞胞胞定定定定对对对对对对对对对因因因因因因定定定定定浓浓浓浓表表表表表表表表表表表表表表表表表表表表表度度度度达达达达达达达达达达达达达达达达达达达达达达达达相相关性分析析图1

曲线,对数生长期,菌株,还原能力

确定与其最接近的种系群体。165:DNA序列分析显示SJI与B“cillus。ereus03BBloZ(Ge祀ank:CP0ol4o7)具有一00%的同源性，因此SJI被命名为Baeilluscereu:SJI。菌株 B.cereusSJI的生长曲线及对铬(Vl)的还原能力见图2.1。B.cereusSJI生长速度较快，在LB培养液中5一7h达到对数生长期。尽管在加入 1mM狡C心4的LB培养基中B.cereu、SJI在5一7h也能达到对数生长期，但是其OD值明显低于不加铬(VI)时的OD值，说明狡CrO4对菌株 B.cereusSJI的生长还是有一定的抑制作用，该抑制从一个侧面说明了从Cro;对细胞具有毒害作用。 B.cereusSJI在57h内能将lmMKZCrO4还原至O.O3mM，约还原了97%(图2.1)。

【参考文献】