基于傅里叶变换红外光谱的生物毒性测试方法及咪唑类离子液体毒性作用机制研究

发布时间：2020-09-09 12:45

　　 近年来,环境污染问题已成为全球三大危机之一。各种污染物的大量排放给我们的生存环境产生了巨大影响,而目前对大量污染物的分布情况尤其是其毒性仍不清楚,无法有效评价污染物对生态环境的影响。传统的生物毒性测试方法是基于单一毒性终点(致死、抑制生长等)对污染物的环境效应进行评估。而单指标毒性测试方法很难准确反映污染物对环境的全部影响。因此,发展多水平和多指标的毒性测试方法对明确污染物毒性效应,评估化学品的环境风险具有重要意义。本文针对目前常规生物毒性测试存在的问题,建立了基于傅里叶变换红外光谱的生物毒性测试方法。通过对样品固定方式和仪器测量方法等的优化,与传统毒性测试方法进行比较,论证了运用傅里叶变换红外光谱进行生物毒性测试的可行性。并进一步从生物大分子水平入手,运用傅里叶变换红外光谱,并结合细胞毒理学研究方法,对离子液体毒性效应及作用机制进行了深入分析。所取得的主要进展包括:(1)优化了傅里叶变换红外光谱生物毒性试验的前处理方法和分析测试方法。本文选取三种常用的生物样品固定液(70%乙醇、卡洛氏溶液、10%福尔马林溶液),对红外光谱生物毒性测试的前处理方法进行比较,结果表明:卡洛氏溶液对生物分子的影响最为显著,70%乙醇固定方法会溶解细胞内脂质物质从而影响对脂质分子的研究,而10%中性福尔马林溶液对样本进行固定后,在生物大分子水平上的变化情况最小。通过比较测量模式和调试生物样品红外光谱测量参数发现,当设置分辨率为8 cm~(-1),扫描次数为64,以透射模式对浮萍样品进行红外光谱扫描可以获得较为丰富和准确的生物大分子信息。(2)在污染物毒性测试研究中,分析了有机助溶剂的使用对毒性效应的影响。结果表明:乙醇和甲醇两种有机溶剂,即使处理浓度很小,也会对浮萍和绿藻的生长及生物大分子水平产生影响;丙酮在OECD建议浓度(0.01%v/v)下毒性效应较小;相比于其他溶剂,DMSO在剂量低于0.1%v/v时对浮萍的影响较小。因此,在水生生物毒性测试研究中,甲醇和乙醇不宜作为有机助溶剂,而0.1%v/v浓度下的DMSO是较为合适的有机助溶剂。(3)以重金属离子(Cu和Cd)和农药(阿特拉津和乙草胺)为目标化合物的浮萍生物毒性测试中,通过对傅里叶变换红外光谱毒性测试方法与传统毒性测试方法进行对比研究,结果发现,基于浮萍的傅里叶变换红外光谱的生物毒性测试方法具有较高的额灵敏度,同时能获得受试生物在外界刺激下机体内生物大分子的变化信息。通过综合分析脂质、蛋白质、DNA和多糖等生物大分子的变化情况,能够更加准确地检测和评估污染物的毒性效应。此外,金属和农药的联合毒性评价发现:重金属离子和农药由于各自作用方式的不同,对受试生物的联合毒性效应也各不相同。在环境样品的生物毒性测试研究中,由于不同样品中污染物成分和浓度不同,对受试生物的影响不相同,与受试生物相互作用时引起生物体内大分子的变化也不相同,根据生物大分子的变化信息可以推测引起受试生物毒性效应的化合物作用方法,进而为环境样品的生物毒性测试提供方向。(4)通过傅里叶变换红外光谱对咪唑类离子液体的毒性进行了研究。以不同烷基链长度的咪唑氯盐为研究对象,大肠杆菌、羊角月牙藻和Hela细胞作为受试生物,分析了离子液体在不同处理浓度和不同烷基链长度下对受试生物的毒性效应差异和变化规律。另外,基于不同处理浓度和烷基链长度下受试生物细胞内生物大分子的变化情况以及对生物大分子(如蛋白质、脂质和DNA)的光谱信息分析探讨了其可能的毒性作用机制。研究发现,当受试生物与离子液体相互作用时,主要通过诱导体内产生活性氧,通过产生过量的活性氧对细胞膜和细胞器膜产生氧化性损伤,从而影响细胞的流动性和通透性;ROS通过与细胞膜蛋白、功能性蛋白及酶蛋白等相互作用,可以氧化性修饰蛋白质上的氨基酸侧链残基以及造成肽键断裂,主要是针对蛋白质二级结构、氨基酸残基及蛋白质翻译后修饰水平等的影响;ROS通过与DNA分子相互作用,对DNA分子的结构产生影响。通过诱导ROS的产生,进而对细胞器及生物大分子产生氧化性损伤,最终导致受试生物的增殖抑制或者死亡。(5)研究了不同浓度和烷基链长度的离子液体对细胞周期、凋亡和自噬的毒理学机制,结果表明:随着离子液体处理浓度和烷基链长度的增加,细胞周期阻滞、凋亡和自噬现象也随之增加。说明在离子液体的作用下,通过对周期的阻滞、凋亡和自噬对细胞产生增殖抑制或者造成细胞死亡。另外,也分析了离子液体对细胞内ROS产率的影响,结果表明:随着离子液体处理浓度和烷基链长度的增加,ROS的产率显著增加。说明细胞的周期阻滞、凋亡和自噬是在ROS的介导下发生的。通过对细胞超微结构和细胞骨架结构的分析发现线粒体和细胞膜对离子液体的响应最为明显。随着离子液体处理浓度和烷基链长度的增加,线粒体膜电位降低、自噬增加,细胞膜的结构完整性遭到破坏,细胞骨架微丝断裂。这一结果表明离子液体与细胞相互作用,引起细胞膜的通透性增加,细胞膜通透性孔道的高水平开放,使得膜电位迅速下降。进而诱导细胞内GSH的下降和ROS的增加,最终导致细胞凋亡和自噬。膜通透性的改变还会影响线粒体基质的渗透压,引起线粒体的肿胀及破裂,影响细胞能量代谢机制的运行。最后,从DNA角度进行分析发现随着离子液体处理浓度和烷基链长度的增加,细胞核的完整性遭到破坏,细胞核碎片化现象严重,细胞周期发生阻滞。说明离子液体与细胞相互作用时,会引起DNA分子的损伤,进而影响细胞增殖。研究表明,基于光谱信息的离子液体毒性作用机制与细胞毒理学方法相互印证,且光谱手段还具有简单、快速和样品无损的特点,因此傅里叶变换红外光谱分析在生物毒性测试研究中的应用具有广阔的前景。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院广州地球化学研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X171.5
【部分图文】：

的生物样品分析方法，能够提供独特的、非标记性的分子组成信息，已然成为生物分子结构研究的重要方法之一，被广泛应用于生命科学等各个领域。红外光谱的工作原理如图1.1所示，从光源发出的一束红外光经迈克尔逊干涉仪形成干涉光，到达检测器再经傅里叶变换对光谱信号处理，最后得到该样品的红外吸收峰。生物大分子产生红外吸收的主要区域在3050-2800 cm-1和1800-900 cm-1这两个波段，前者被称为CH振动区，后者被称为生化指纹区。CH振动区主要反映的是CH键的伸缩振动，与脂质烷基链结构息息相关，主要包括=C-H伸缩振动，CH2和CH3的对称和反对称伸缩振动。生化指纹区主要反映的是生物大分子基本振动模式（Bakeretal.,2014），包括与脂质相关的C=O（1740cm-1）、蛋白质二级结构相关的酰胺I（1650 cm-1）、酰胺II（1540 cm-1）、酰胺III（1300cm-1）、与游离氨基酸相关的COO-（1400cm-1）、与核酸结构相关的PO2-的对称（1080cm-1）和反对称伸缩振动（1250cm-1）以及与碳水化合物相关的C-OH（1030cm-1）的振动（Movasaghi et al.

光谱数据一般采集 4000-400 cm-1范围内的振动信息。对生物行分析的数据包括与 CH 伸缩振动相关的 3050-2800cm-1和与的 1800-900 cm-1的光谱信息。对于生物样本而言，其主要的、蛋白质、核酸和糖类等。通过对上述生物分子的光谱信息解谱信息相关的生物大分子在结构与功能上的变化情况。与脂质收主要包括烷基链结构（CH2和 CH3）、羰基及磷酸基团的振动吸收峰的分析可以得出与细胞膜脂质结构及膜脂过氧化程度的子相关的振动信息主要包括酰胺 I，酰胺 II，游离氨基酸残基的振动信息。通过对酰胺I结构的分析可以得到蛋白质二级结构酸的分析可以得到细胞内氨基酸侧链信息及蛋白质翻译后修核酸振动信息相关的吸收峰的分析可以得到与 DNA 二级结构

图 1.3 细胞及脂质、蛋白质和 DNA 的红外光谱图Figure 1.3 The IR spectra of cell, lipid, protein and DNA3 红外光谱在毒理学研究中的应用3.1 FTIR 的在生物大分子研究中的应用生物样本的红外光谱是由细胞内生物大分子，如蛋白质、脂质、核酸和糖类贡献。尽管各生物分子相当复杂，但其均具有独特的特征，而且在光谱波段能很好区分（Martinetal.,2010）。如果将一个细胞看作是各生物大分子的一个混物，那么每一个细胞都将具有一个独特的红外吸收形式，呈现出一个独特的光信息。当细胞受到环境胁迫，或者发生病变的时候，胞内相应的大分子在组成结构上则会出现一定程度的变化。当这种变化通过光谱的形式被采集时，则会过红外谱图展现出来（Trevisan et al., 2012)。深入了解生物样本的红外光谱，

本文编号：2814991