基于稳定同位素探针技术的多环芳烃降解微生物研究

发布时间：2020-09-09 22:02

　　 随着社会经济的高速发展,人类活动造成的多环芳烃(PAHs)污染越来越严重。这类物质具有致畸、致癌、致突变的潜在危害,对生态环境和人体健康构成严重威胁。生物降解是去除环境中PAHs的最主要、最有效的途径,微生物在PAHs降解过程中起着非常重要的作用。从复杂的环境样品中将功能微生物分离出来,并对其进行详细完整的遗传、代谢分析,一直以来是环境微生物学研究中遇到的最大的挑战之一。利用传统的分离方法可直接从环境样品中筛选出功能微生物,并可对其形态特征、生理生化特征、代谢以及遗传信息进行研究。然而该方法只能从环境中获得不到1%的微生物,因而存在很大的局限性。此外,纯培养条件下生态位的改变、共代谢及群体感应系统的崩溃等因素也会导致微生物的可培养性降低。因此,急需新的生物学方法克服这一技术瓶颈。本文应用DNA稳定同位素探针(SIP)联合高通量测序技术鉴定参与石油污染水体中菲降解的功能微生物种群,同时利用传统的纯培养方法分离菲降解菌;随后,将分离获得的关键细菌应用于原污染水体生物修复,明确其与功能微生物群落的相互作用机制,以期在原位条件下达到最佳修复效果;另外,我们应用原位根际SIP技术探究根系分泌物和根际作用对污染土壤中PAHs降解微生物的影响,探究根系分泌物在原位植物根际修复过程中的作用;最后,鉴于SIP在识别功能微生物时出现的低分辨率问题,我们将SIP结合磁性纳米颗粒介导分离(MMI)技术,即MMI-SIP技术,对PAHs污染水体中的菲降解功能微生物进行鉴定和分离,以期在复杂体系中更精准地识别功能微生物。主要结论如下:(1)应用DNA的稳定同位素探针(DNA-SIP)和高通量测序技术,对石油污染水体中参与菲降解过程功能微生物种群进行原位探查,并将探查结果与室内培养分离实验结果相对照,成功确认、分离出一株在污染水体中原位降解菲的高效菌株。研究中,DNA-SIP结果表明,参与菲降解的土著功能微生物包括Acinetobacter、Sphingobium、Kouleothrix和Sandaracinobacter,其中Kouleothrix和Sandaracinobacter对菲的降解能力首次得到证实。通过优化各种实验条件,成功分离获得在原位条件可降解菲的新菌株Acinetobacter tandoii sp.LJ-5,该菌可通过β-ketoadipate途径降解菲。该项工作为原位功能微生物的探查和分离确认,提供了一个成功的技术范例。(2)添加LJ-5能够显著增加菲的生物降解效率,然而DNA-SIP结果显示LJ-5并没有参与菲的降解,菲降解效率的提高主要是由于添加LJ-5改变了原体系中的土著功能微生物群落,增加了功能微生物群落的多样性。未接种LJ-5时,PAHs污染水体中的土著功能微生物主要为Rhodoplane、Mycobacterium、Xanthomonadaceae和Enterobacteriaceae,添加菌株LJ-5后,除了Mycobacterium和Enterobacteriaceae保持菲降解功能外,另五种不同的菌群Bacillus、Paenibacillus、Ammoniphilus、Sporosarcina和Hyphomicrobium表现出菲降解能力。另外,功能基因的变化也佐证了以上的结论。该结果为微生物强化污水处理作用机制提供了一个全新的解释,为石油污染水体生物修复提供了技术支持和理论依据,同时也为污染水体中PAHs降解功能微生物群落的多样性提供了更全面的认识。(3)黑麦草根际作用能够提高菲的生物降解能力,但是实验证明并非根系分泌物促进了菲的生物降解,根系分泌物在PAHs根际生物修复过程中只起了很小的作用。结合原位根际SIP和功能基因的定量结果发现,功能基因和菲降解菌的丰度与菲降解效率之间均存在显著的正相关关系。鉴定的所有功能微生物来自八个纲(Class),其中Alphaproteobacteria和Nitrososphaeria均存在于未处理土壤(AD)、根际处理土壤(RG)和根系分泌物处理土壤(RE)中,Sphingobacteriia和Actinobacteria分别存在于AD+RG、RG+RE两个处理组中,其他的四种功能微生物群落仅存在于AD或者RE中。以上发现说明来源于同一土壤的微生物其功能会随着所处环境的变化而变化。在所有探查出的功能微生物中,Blastomonas、Sphingoaurantiacus、Ramlibacter、Mucilaginibacter、Pedobacter、Nitrososphaera、Pyrinomonadaceae、Chitinophagaceae和Chthoniobacteraceae对菲的降解能力首次得到证实。本研究明确了根系分泌物在根际生物修复PAHs过程中的作用,为PAHs污染的原位植物修复提供了理论依据,同时也为PAHs降解过程中根际菲降解微生物群落多样性提供了更全面的认识。(4)将MMI和SIP技术结合发展出一种新型MMI-SIP方法,用于从PAHs污染水体中鉴定和分离菲降解功能微生物。SIP结果表明,参与菲降解的功能微生物为Pseudomonas和Sphingobium;与MMI技术结合后,MMI-SIP不仅能够显著增加Pseudomonas和Sphingobium在~(13)C-DNA中的富集,同时识别出另一种菲降解菌Pigmentiphaga。我们的研究结果表明,MMI-SIP是一种能够从复杂的微生物群落中识别出不可培养功能微生物的方法,与MMI或SIP相比,MMI-SIP具有更高的分辨率和准确性。同时,功能基因的富集趋势进一步证实了以上结论。此外,该方法通过MMI技术成功地分离出菲降解功能微生物并显著增加PAHs污染水体的菲生物降解效率。本研究表明MMI-SIP技术是一种具有高分辨率的功能微生物识别工具,可以准确地从复杂微生物群落中分离鉴定活性菲降解微生物群落。该结果为能降解其他有机污染物的功能微生物识别提供更高的准确度和分辨率,有助于更精确地探讨它们在污染物降解过程中的生态作用和影响因素。综上所述,结合稳定同位素探针和高通量测序技术,能够有效地原位探查污染环境中参与菲降解过程的功能微生物种群,并利用纯培养方式成功确认、分离出一株在污染水体中原位降解菲的高效菌株;该菌株能够通过改变功能微生物群落,增加功能微生物群落的多样性来促进多环芳烃污染物的微生物降解;同时,发展了原位根际SIP技术清晰地阐明根系分泌物在根际微生物修复PAHs污染物过程中的作用;为提高SIP技术在功能微生物识别方面的分辨率,本文大胆地将以上SIP技术与MMI技术相整合,大大提高了SIP技术在功能微生物探查方面的精准性,是相关研究领域一项典型的创新工作。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院广州地球化学研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X592;X172
【部分图文】：

图 1-1 菲的化学结构图Figure 1-1 Chemical structure of phenanthrene够分泌大量的氨基酸、有机酸等化合物，为微珠, 2008)。此外，这些根系分泌物能够改变土机物污染物的生物降解产生影响。2011 年, C染土壤中添加根系分泌物探究其对菲降解功能

图 2-7 (a) 固体培养基上生长的 LJ-5 单菌落 (b) LJ-5 透射电子显微镜图：无鞭毛，比例尺为 0.5 和 1 μm。Figure 2-7 (a) Photograph of LJ-5Tcolonies on LB media plate; (b) Electron micrograph of cellsof strain LJ-5T. Bar, 500 nm (left) and 1000 nm (right).如图 2-8 所示，在相应液体培养基中，LJ-5 能够在 25-40 ℃温度范围内生长，最适生长温度为该菌的富集温度 30 ℃；该菌能够在 5.0-9.0 的 pH 条件下生长，最佳生长 pH 为 7.0；LJ-5 的盐耐受能力较弱，只能在盐浓度为 0-3%的条件下生长，且在 0%的盐浓度下长势最好。0.20.40.60.81.01.20.20.40.60.81.01.21.41.60.70.80.91.01.11.21.3Opticaldensity(OD600)

图 2-9 LJ-5 和其相关菌的基于 16s rRNA 基因序列的系统发生关系，构建方法为邻接法，自展值设定重复 1000 次，图中仅展示了自展值大于 50 %的结果，比例尺 0.01 代表每个核苷酸的替换率。Figure 2-9 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences showing the phylogeneticposition of A. tandoii LJ-5 and representatives of other related taxa. Bootstrap values >50% areshown at the branch points. Bar 0.01 substitutions per nucleotide position.根据以上实验结果，确定了菌株 LJ-5 的最佳生长。该菌株在不同菲浓度（100-1000 mg/Ｌ）中的生长及降解实验均在这个条件下进行。图 2-10 显示了菌株 LJ-5 在不同浓度菲的无机盐培养基中生长曲线及降解特效率。结果表明，LJ-5 能够在高浓度菲条件下生长。在菲初始浓度较低（100 到 200 mg·L-1）的无机盐培养液中培养 3 天后，其降解率均可达到 80%以上；在菲初始浓度在 400到 1000 mg·L-1的无机盐培养液中培养 7 天后，降解率均可达到 60%以上。以上结果说明菌株 LJ-5 是一种能降解菲且耐受菲能力很强的菌株。另外，

本文编号：2815528