铜绿假单胞菌DN1高产鼠李糖脂基因工程菌株的构建及其对石油污染土壤修复的实验研究

发布时间：2020-09-16 10:43

　　 石油污染是亟待解决的环境问题之一,生物修复被认为是理想的方法。石油污染物由于水溶性小致使生物可利用性低,一般需投加表面活性剂提高其修复效率。鼠李糖脂作为一种生物表面活性剂,具有无毒、易降解、可增溶疏水性有机物等优点而具有广阔的应用前景。然而,由于鼠李糖脂的生产成本高、产量低等问题而没有被广泛使用。本论文以产鼠李糖脂表面活性剂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DN1为研究对象,构建高产鼠李糖脂基因工程菌株并对营养参数进行优化,促进其产鼠李糖脂的能力,在此基础上探究鼠李糖脂协同降解菌在修复石油污染土壤的应用潜力。首先利用分子生物学手段将鼠李糖脂合成关键基因rhlAB和rhlC分别转入铜绿假单胞菌DN1,构建基因工程菌株DNAB和DNC;然后对微生物摇瓶生产鼠李糖脂过程中的营养参数进行优化。结果表明:以6种碳源(棕榈油、菜籽油、豆油、甘油、玉米油、橄榄油)为唯一碳源培养时,橄榄油是最佳的碳源;6种氮源(氯化铵、硝酸钠、硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、尿素)为唯一氮源,最佳氮源是硝酸钠。当C/N比为20时,工程菌株DNAB和DNC的鼠李糖脂产量分别达到19.3g/L和22.5g/L,相比DN1的14.2g/L增加到1.35倍和1.58倍。由此可见,增加菌株DN1的rh1AB和rh1C的基因拷贝数并进行营养参数优化,可以提高鼠李糖脂的产量。同时,通过ESI-MS分析得出野生型和工程菌株之间的鼠李糖脂种类和数量差异,发现Rha-Rha-C_(10)和Rha-Rha-C_(10)-C_(10)是工程菌株产生的最优势的鼠李糖脂结构。在此基础上利用鼠李糖脂协同降解菌对石油污染的土壤进行修复,通过检测石油烃的降解效率以及石油污染土壤本源微生物种群多样性的变化,探究投加鼠李糖脂协同降解菌的修复效果。结果表明:35天的修复过程中,相比较未经处理(NA)的石油烃去除率43%,鼠李糖脂协同降解菌修复(BMR)对石油烃的去除效果最好,可达到81%,只施加降解菌修复(BM)对土壤中石油烃的去除率为63%,而只添加鼠李糖脂修复(BR)没有明显提高石油烃的降解率(39%)。多样性分析表明,与未经处理(NA)的土壤微生物多样性相比,只添加鼠李糖脂(BR)和只采用降解菌的修复(BM)提高了土壤微生物群落的丰富度,鼠李糖脂协同外源降解菌的修复(BMR)不仅可以提高土壤群落的丰富度,而且提升了土壤群落的均匀度。属水平上发生极大变化,未经处理的(NA)土壤的优势属有诺卡氏菌属(Nocardioides)和戈登式菌属(Gordonia),仅施加鼠李糖脂修复(BR)和只添加降解菌修复(BM)出现新的优势属为假单胞菌属(Pseudomonas),而诺卡氏菌属(Nocardioides)丰度下降;鼠李糖脂协同降解菌修复(BMR)的土壤中出现更多新的石油烃降解优势属,如分枝杆菌属(Mycobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacte)、根瘤菌属(Rhizobiaceae)、空洞菌属(Cavicella)和黄假单胞菌(Pseudoxanthomonas)等,这些石油烃降解优势属的增加显著提高降解菌对土壤中石油烃的去除效果,使得土壤中石油烃降解率可达到81%。此外石油烃降解相关酶丰度的变化结果表明了鼠李糖脂提高了与碳氢化合物降解和转运蛋白有关的酶,增强了降解细菌向修复部位的转运并促进生物降解碳氢化合物。由此可见,鼠李糖脂协同降解菌能有效去除石油污染土壤中的石油烃,并使土壤微生物群落结构发生明显变化,使得易降解石油烃的微生物更富集,在石油污染土壤修复方面具有应用潜力。
【学位单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X53;Q78
【部分图文】：

表面活性剂是具有极性和非极性部分的两亲化合物，它们的烷基接，产生亲水和疏水区域[52]。按照表面活性剂的来源分类，可以将表面物表面活性剂、化学合成表面活性剂和天然表面活性剂[53, 54]。表面活性，其中之一为污染修复。面活性剂对石油污染土壤的作用机理微生物产表面活性剂来提高对石油污染土壤的修复通常由两个过程构成第一个过程包括提高微生物对难溶底物的生物可利用度。第二个过程包括增强细胞表面的相互作用，增加疏水性，使细菌容易石油烃[55, 56]。活性剂通过溶解或乳化石油烃来帮助降解[57]，通过微生物[58]或增强土增加碳氢化合物的界面吸收。此外，表面活性剂具有减弱微生物的吸附转运到石油污染修复场所的能力[59]。图 1 显示了修复过程中表面活性剂，微生物和土壤之间的相互作用。由于分子中存在羧酸，鼠李糖脂是弱酸并且可以在溶液中发生

西北大学硕士专业学位论文颗粒的头部之间的排异，从而促进石油污染物与土壤颗粒的隔离[60]。另一方面于或高于 CMC 的表面活性剂可形成聚集体并增强碳氢化合物的溶解，并显著相中污染物的分配（图 2）[61]。我们 Helvaci 等人报道，作为 NaCl 浓度的函数，在鼠李

李糖脂和苯乙烯浓度的函数。结果，基于对 SANS 数据的分析，提出了从圆柱形胶束到由升高的鼠李糖脂和苯乙烯浓度诱导的圆柱形胶束和囊泡的二元混合物的结构转变。最近，Zhong 等人报道，即使在低于基于表面张力的 CMC 的浓度下，双-鼠李糖脂也可以自组装成球形聚集体，并且增加的二乙醇脂浓度和溶液 pH 导致聚集体尺寸减小。图 2 表面活性剂洗涤土壤石油烃的示意图ig.2 Schematic diagram of rhamnolipid-enhanced soil washing for removal of petroleum油烃是一种具有疏水性质的碳氢化合物，在水中表现出低溶解度并偏向于分中[55]。尽管微生物可以通过适当的营养浓度，pH 值，和氧来促进降解，但低溶解度和疏水性使得微生物难以利用[62]。表面活性剂是微生物采用的增加性和石油烃降解的策略之一，表面活性剂可增强石油烃的乳化，以形成在油的积累的胶束。因此，如图 3 所示，表面活性剂导致表面张力降低并增强微氢化合物的吸收。鼠李糖脂可以改变细胞表面疏水性（CSH）。可以通过在

【参考文献】

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本文编号：2819757