碳源对水稻土中铁还原特征和铁还原菌多样性的影响

发布时间：2020-09-18 07:42

　　微生物Fe(Ⅲ)还原作用能以Fe(Ⅲ)作为电子受体,将有机或无机的电子供体氧化。自然界的厌氧环境几乎都有异化Fe(Ⅲ)还原现象,并有铁还原微生物存在。关于水稻土微生物铁还原过程的知识在最近十年里持续的增加。然而因为铁还原微生物系统发育学上的多样性和铁还原途径的不确定性,使得人们对铁还原微生物的认识仅限于几类典型的物种,如Geobacter和Shewanella。水稻土水旱轮作的耕作方式作为研究氧化还原过程的一种模式系统一直受到人们的重视,其中铁的氧化还原占有重要地位。但对其淹水厌氧状态下微生物群落的分布演替的知识甚少,缺乏对铁还原过程具有贡献率的细菌的相关报道。所以,研究不同碳源富集下水稻土中Fe(Ⅲ)微生物的优势类型,不仅可深化对水稻田微生物生态的认识,而且对于阐明水稻土微生物Fe(Ⅲ)还原机理及群落演替特征具有重要的意义。本文采用厌氧恒温培养方法,在自然和有机质耗竭水稻土中添加无定形氧化铁和不同碳源进行富集驯化,分析铁还原特征;进一步分离筛选出具有高效铁还原能力的菌株,采用16S rDNA-ARDRA分子生物学技术对其多样性进行分析评价;并对典型菌株进行16S rDNA序列测定。直接分离纯化铁还原环境下水稻土中的微生物,通过直接测定其16S rDNA序列,认识其在系统分类学上的归类。比较不同淹水时间及在外加碳源和铁源驯化下微生物群落结构的差异,分析其优势种群的演替特征。提取来源不同植稻区水稻土不同淹水时期的微生物群落,接种于以不同碳源为惟一底物的富铁培养液中,定期测定Fe(II)生成量,pH变化及脱氢酶活性,探索铁还原微生物的活性出现的最大时期及稳定期,以得到铁还原微生物活性恢复最快的时期,为研究不同水稻土微生物铁还原能力差异和影响因素提供基础依据。通过对微生物Fe(Ⅲ)还原过程和脱氢酶活性变化的动力学特征分析,以期阐明脱氢酶活性与微生物Fe(Ⅲ)还原的内在关系,为揭示水稻土中微生物Fe(Ⅲ)还原机理提供必要的理论依据。本论文的主要结果包括以下方面: (1)在有机质耗竭水稻土中添加葡萄糖和丙酮酸盐后,其铁还原反应的趋势跟自然水稻土比较接近,而添加乙酸盐的处理则表现出一定差异。表明淹水水稻土中铁还原反应在初期的快速进行是由利用葡萄糖的发酵产H2型铁还原菌所主导的,淹水后期的铁还原反应则是由利用乙酸盐的铁还原菌所控制。H2-依赖型铁还原菌对水稻田中的铁还原过程的贡献大于乙酸依赖性。 (2)铁还原微生物群落组成与结构是影响水稻土中铁还原过程的重要因素。在接种土壤浸提液的混合培养中,不同淹水时期对Fe(Ⅲ)还原特征值Vmax的影响显著,表现为淹水20 d30 d12 d1 d5 d,水稻土中微生物群落结构变化是导致Fe(Ⅲ)还原能力不同的主要原因。不同淹水时期得到的铁还原微生物群落对碳源的响应具有显著差异,淹水1~12 d的处理以葡萄糖和丙酮酸盐为优势碳源,淹水12 d和20 d的处理能够高效利用乳酸盐,淹水30 d的处理对乙酸盐的利用能力显著增强。 (3)柠檬酸铁的生物还原和化学还原具有显著的不同,光照和高温是影响柠檬酸铁化学还原的主要原因,避光和30℃培养条件不会造成柠檬酸铁的化学还原。本试验条件下的接种了微生物的柠檬酸铁还原主要是由微生物引起的。建立了有效筛选铁还原菌株的分离培养方法体系,判定ferrihydrite还原率在50%以上的菌株为高效铁还原菌。在不同碳源富集下,从吉林,四川,湖南,浙江,天津和江西水稻土获得高效铁还原菌株分别为88,54,161,88,33和67个。 (4)α多样性指数表明在葡萄糖富集下出现较为集中的优势种群,而在小分子有机酸为碳源的处理中则呈现出较为丰富的多样性。在HN水稻土中,基于16S rDNA-ARDRA分析,其优势种属一共分为7类。不同碳源富集下都均有Paenibacillus spp.和Clostridium.spp.出现;Solibacillus和Lysinibacillus是乙酸盐富集下的优势种群,而Bacillus则是丙酮酸盐富集下的优势种属;除了葡萄糖处理,其他碳源富集及对照中都表现出Azotobacter为其优势物种;而Pseudomonas spp.作为优势物种只出现于葡萄糖富集的群落中。 (5)微生物Fe(Ⅲ)还原过程对脱氢酶活性具有明显的影响,不同处理中脱氢酶活性最大值对应的Fe(II)含量为91.0~344.6 mg·L-1,随着铁还原程度的继续增大,脱氢酶活性随之降低。不同处理中脱氢酶活性与微生物Fe(Ⅲ)还原过程具有相关性,脱氢酶活性峰值出现时间与Fe(OH)3还原TVmax具有显著正相关关系,而与Vmax则表现为明显负相关。脱氢酶活性是影响水稻土中铁还原过程的重要因素,推测微生物代谢有机物产H2是水稻土淹水初期铁快速还原的主要原因。 (6)自然淹水条件下,水稻土中早期出现的可分离株采用r-策略进行生殖生长,物种多样性相对丰富,可归属于Lysinibacillus,Staphylococcus,Paenibacillus和Azotobacillus的系统发育分支上;演替后期铁还原过程进入平稳阶段且出现相对集中的类群,主要以Bacillus spp.为优势物种代表。在外加碳源和氧化铁富集下,水稻土中可分离株的群落结构发生显著变异。通过本文的研究,对不同碳源富集下水稻土中优势铁还原菌的种属以及铁还原环境下的微生物群落的演替有了更为深入的认识,探讨了脱氢酶活性跟微生物铁还原过程之间的联系,为进一步明确我国水稻土淹水培养后铁还原菌群落结构特征及系统分类、探讨不同水稻土中微生物铁还原能力差异提供基础依据,也对水稻土微生物Fe(Ⅲ)还原机理提出了初步的构想。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：X172
【部分图文】：

土壤图,体系图,图论聚类分析,淹水时间

图 3-6 不同淹水时间处理不同水稻土的两维图论聚类分析Fig. 3-6 Two-dimensional graphic cluster of paddy soils in different flooding time treatments3.2.5 铁还原条件下利用不同碳源的 pH 变化土壤浸提液试验中，不同淹水时期得到的微生物群落利用外加碳源及对照体系中pH 值变化见图 3-7 至 3-11。当培养体系中没有添加碳源时，对应各土壤不同淹水时期处理中几乎无 Fe(II)产生，其 pH 基本维持在初始的中性 pH（图 3-7），说明在无碳源供给的情况下，微生物的生理代谢反应停滞；同时也表明 Fe(III)还原过程是在微生物作用下的酶促反应，当铁还原微生物的活性钝化时，Fe(III)还原反应不能正常进行。0 10 20 30 40 506.87.27.68.08.4 1 dJL Ck5 d12 d20 d30 dHp0 5 10 15 20 25 306.87.27.68.08.4TJ Ck1 d5 d12 d20 d30 dHp

固体培养基,测定方法,厌氧,富集条件

Fe(II)生成量测定方法用自动加样器吸取 1 mL 培养样品置于含 4 mL 0.5 mol L-1HCl 的聚乙烯管中下浸提 24 h(Schnell and Ratering 1998)，每个处理设置 3 个平行。测定方法同 2结果与分析厌氧富集条件下可培养微生物的长势厌氧泥浆培养条件下，接种了不同碳源富集处理液接种的固体平板基上的菌落 4-1 所示。

能量图,过程图,铁还原菌,试验结果

将得到的 Fe(OH)3铁还原率大于 50%的菌株接种到含有 Fe(OH)3的液体培养基（图4-4A）以及斜面固体培养基（图 4-4B）进行穿刺试验。如图 4-4A 所示，从左至右所示为接种了铁还原菌的红棕色 Fe(OH)3培养液逐渐还原为无色亚铁的过程；图 4-4B 显示了将铁还原菌穿刺到 Fe(OH)3固体培养基后，与不接种的对照试管相比，一定培养时间内培养基颜色消退变浅，再次验证本方法体系下筛选得到的菌株是高效铁还原菌。AB图 4-4 铁还原菌的液体培养试验（A）和穿刺试验结果（B）Fig. 4-4 Results of iron reducers in a liquid culture test (A) andPuncture test (B)4.3 讨论传统上，铁还原菌的定义是在厌氧条件下，能以三价铁作为电子受体氧化有机物获得能量支持生长的微生物，但对“三价铁”的定义却没有严格的定义。在自然界中，铁很少以纯净的晶体态形式(Kappler and Straub 2005)，大部分是和其他元素共存形成氧化矿物或形成有机螯合物以及纳米颗粒聚合物类似的胶体。如此复杂的自然体系提供了各种各样的微生态环境，这也就导致了许多铁还原菌在实验室条件下生长不好的原因。其中最主要的因素是铁在中性pH环境下呈现固态，从而不容易和微生物直接接触。为了克服克服中性pH条件下Fe(III)的不可溶性，许多研究通过添加螯合剂来溶解Fe(III)，如用柠52

【引证文献】