糙皮侧耳响应木质素分子机制研究

发布时间：2020-09-18 22:12

　　白腐菌是自然界中唯一能彻底降解木质素的真菌,研究发现白腐菌对木质素、木质素结构类似物具有良好的适应性和耐受性,然而白腐菌是如何响应木质素环境的研究目前知之甚少。为了深入探究白腐菌对木质素的响应机制,本研究以具有木质素降解能力的白腐真菌糙皮侧耳BP2作为研究对象,对糙皮侧耳在不同木质素体系下的胞内蛋白和分泌蛋白表达差异进行分析,并从关键功能基因转录水平,生物学特性,木质素组分结构变化等方面研究了糙皮侧耳对不同木质素体系的响应机制。主要结论如下:(1)木质素对糙皮侧耳的氧化胁迫效应木质素在糙皮侧耳BP2液体培养基中能引起胞内氧化过程相关蛋白表达显著上调,胞内氧化水平显著上升,而同时戊糖代谢途径、TCA循环、糖酵解过程相关的酶的表达受到抑制,导致菌丝生长缓慢。进一步以木质素含量分别为36%和20%且富含S型单体结构的两种硬木,以及木质素含量仅为12%缺少S型单体结构软木作为基质,研究了糙皮侧耳BP2对具有不同类型的木质纤维素的响应差异,结果显示硬木培养体系中响应木质素的氧化过程相关蛋白显著上调,同时体系内氧化水平显著上升,葡萄糖代谢相关蛋白显著下调。表明木质素的存在对糙皮侧耳具有氧化胁迫效应,在天然木质纤维素中,胁迫程度因木质素的含量和结构而异。(2)木质素氧化胁迫效应启动了糙皮侧耳胞内抗氧化胁迫机制在液体培养体系中,糙皮侧耳BP2胞内抗氧化、抗胁迫相关蛋白表达上调,超氧化物歧化酶,过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶等活性提高,有效降低细胞内过氧化氢和氧自由基水平,使其生长速率加快,解除了木质素的胁迫效应。在木质纤维素培养体系下也有类似规律,在硬木中,糙皮侧耳BP2的抗胁迫相关蛋白以及木糖代谢关键蛋白表达显著上调,有效降低体系内氧化水平,提高菌丝生长速率,糙皮侧耳通过启动抗胁迫机制和碳源利用策略提高其在硬木中的适应性。(3)糙皮侧耳的分泌功能蛋白对解除木质素及其水解产物胁迫有重要作用液体培养体系下,糙皮侧耳BP2分泌蛋白中与木质素降解相关主要有漆酶、芳基醇氧化酶、草酸脱氢酶,在木质素存在下表达显著上调,起到平衡胞外氧化水平以及降解木质素的作用。硬木和软木培养下,分泌蛋白中与木质素降解相关蛋白多达27种,硬木中木质素酶丰度较高,其中Glass II的过氧化物酶起主导作用,GMC家族蛋白芳基醇氧化酶、乙二醛氧化酶起到辅助作用,这两类酶对木质素结构起到重要修饰和解构作用,相同时间内硬木中木质素的降解百分率为软木的两倍,除此之外,GMC家族蛋白对提高糙皮侧耳的木质纤维素水解产物耐受性具有重要作用。由此可见,糙皮侧耳通过胞外木质素降解酶进一步解除木质素胁迫,增强其对水解产物的耐受性。综上所述,该研究创新性地揭示了在木质素存在体系下,白腐菌通过调节氧化水平、部分碳水化合物代谢、胞外木质素降解酶水平等响应方式对木质素环境从适应到降解,最终解除胁迫。相关研究成果补充与完善了白腐菌降解转化木质纤维素理论基础。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X71;X172
【部分图文】：

白腐菌,木质纤维素,木质素

华中科技大学博士学位论文水解产生的纤维二糖和可溶性纤维寡糖，最终将纤维素水解为小分子葡萄糖，实现结晶维素的彻底水解[28]。白腐菌改性木质素可以将木质素水解产物对环境的危害降低到最小，被认为是目前最安全、无公害的木质素改性方式。白腐菌因其具备独特的胞外降解机制，除了能对木质素进行改性外，还能降解木质素结构类似的有机污染物，因而得到广泛关注。白腐菌胞外降解机制是目前研究较为清楚的，但对于白腐菌如何使木质素高分子发生解聚从而生成木质素单体，进而使单体氧化，破坏芳香环结构的认知有限，对于机理的挖掘未能深入（图 1.1）。

生衍,木质纤维素,水解产物

华中科技大学博士学位论文1.2.4 白腐菌对木质素相关水解产物的解毒机制木质素及其相关的其他组分的水解产物中存在大量的抑制微生物生长的化合物，制约了微生物对木质纤维素的转化利用效率。通过物理或者化学的方法来解除抑制要耗费大量的成本[30]，有背于生物转化的经济原则。木质素是种不溶于水的类苯基丙烷单体组成的芳香族聚合物。水解处理可能导致木质素和糖的进步降解为抑制发酵的三种主要的化合物，步骤：（I）呋喃衍生物（2-糠醛和 5-羟甲基-2-糠醛）；（II）弱酸（主要是乙酸，甲酸和乙酰丙酸）；和（III）酚类化合物（图 1.2）。

糙皮侧耳,木质素,液体培养,半纤维素

图2.1 2-DE图谱分析木质素、半纤维素、CMC液体培养条件下糙皮侧耳BP2胞内差异蛋白。箭头标示的为差异蛋白。（A）Krik 培养基（对照）；（B）添加木质素；（C）添加木聚糖；（D）添加纤维素。等点聚焦 pH 范围为 4-7，蛋白分子量标注在图表左侧。Fig 2.1 2-DE analysis of differential expressed proteins in P. ostreatus grown in liquid substratesupplemented with different components of lignocellulose. Arrows and numbers refer to differentiexpressed proteins (A) Kirk’s liquid medium(control). (B) Kirk’s liquid medium supplemented witlignin;(C) xylan;(D) CMC. The pH of the isoelectric focusing gel ranging from 4 to 7 is shown on thtop of each gel. Molecular weight (MW) is shown on the left of the gels.差异蛋白根据功能及参与代谢途径可以分为以下六类（表 2.2）：（1）氧化还原蛋白，这类蛋白主要参与细胞内氧化还原过程；（2）胁迫响应蛋白。这类蛋白受细胞应激响应调控，包括应激蛋白和抗氧化蛋白，在细胞受到外界刺激后，起到防止细胞损伤的作用。（3）碳水化合物和能量代谢相关蛋白。这类蛋白参与碳水化合物代谢，为细胞提供能量，影响细胞的生长和代谢。这类蛋白在总蛋白中丰度最高，

【参考文献】