汞是一种对人体有毒害作用的重金属,土壤中的汞能够通过作物吸收并沿食物链传递至人体,在人体中具有累积效应,摄入过多的汞会损害消化、神经、泌尿及循环系统。汞已成为土壤环境质量监测和评价的必测项目之一,其定量检测对于正确评价土壤汞的库存量、及时开展土壤汞的污染修复具有十分重要的意义。荧光分光光度法检测汞具有灵敏度高、检出限低、选择性好、简单快速等特点,已应用于环境监测、食品安全等诸多领域,为快速而准确地定量检测样品中的汞提供了一种非常有效的方法。但是,如何进一步拓展已有的荧光分析法在汞定量检测中的应用范围,建立灵敏度更高、选择性更好的土壤汞检测方法,仍然是当前需要解决的一项重要任务。基于此,本文开展了以下四方面的研究。1、利用无标记的分子信标(MB)、单链核酸(ss DNA)及核酸染料Hoechst 33258建立了一种土壤中汞的定量检测方法。在该方法中,分子信标的茎完全设计成C-G碱基对,环设计为与ss DNA互补但有多个胸腺嘧啶(T碱基)错配的序列。没有Hg2+时,Hoechst 33258与分子信标作用较弱,其荧光信号很弱;有Hg2+时,分子信标的环与富含T碱基的ss DNA通过“T-Hg2+-T”特异性结合形成双螺旋结构(双链DNA),Hoechst 33258与双链DNA作用后荧光信号显著增强,可实现Hg2+的高灵敏检测。在优化条件下,Hg2+浓度在4×10-9-400×10-9 mol·L-1范围内,Hoechst 33258的荧光强度(?I)与Hg2+浓度(C)之间具有良好的线性关系,方法检出限(3σ)为3×10-9 mol·L-1。应用于污染土壤中汞的检测,其平均回收率在98.3%-103.3%。该方法所用的分子信标不需要标记,检测成本低,检测速度快,但相对而言,灵敏度较低。2、利用分子信标、单链核酸(ss DNA)及高灵敏的核酸染料SYBR GreenⅠ,通过同步荧光分析法,建立了一种高灵敏度的土壤汞(Hg2+)定量检测方法。分子信标的荧光基团设计为荧光胺(6-carboxyfluorescein group,FAM),环设计为与ss DNA互补且T碱基错配的序列。在Hg2+存在时,分子信标的环与富含T碱基的ss DNA通过“T-Hg2+-T”特异性结合形成双螺旋结构(双链DNA),分子信标的茎被打开,荧光基团与猝灭基团分开,荧光恢复;同时,核酸染料SYBR GreenⅠ与双链DNA作用,荧光信号显著增强。SYBR GreenⅠ与FAM的最大激发波长与最大发射波长接近,当Hg2+通过同步荧光分析法检测时,两种荧光染料的荧光峰重叠,荧光信号增强,可实现Hg2+的高灵敏检测。在优化条件下,Hg2+浓度在5×10-10-400×10-10 mol·L-1时,SYBR GreenⅠ及FAM总的荧光强度(?I)与Hg2+浓度(C)间有良好的线性关系,方法检测限(3σ)为3×10-10 mol·L-1。该法基于核酸染料SYBR GreenⅠ灵敏度高的特点,结合FAM标记单链核酸,利用SYBR GreenⅠ及FAM总的荧光强度对土壤中的汞进行检测,可显著地提高检测灵敏度,降低其检出限。3、单色荧光定量检测汞时,若样品中存在能与探针反应的核酸,容易产生假阳性信号。为此,利用两条部分互补、富含T碱基染料标记的单链核酸,结合氧化石墨烯(GO),采用同步荧光分析法,建立了一种土壤中汞的双色定量检测方法。这两条单链核酸的3′端分别用6-carboxyfluorescein group(FAM)和6-carboxyx-rhodamine(ROX)两种染料标记。没有Hg2+存在时,染料标记的单链核酸被吸附在GO的表面,荧光被猝灭,信号很弱;有Hg2+存在时,两条染料标记的单链核酸与Hg2+通过“T-Hg2+-T”结构特异性结合,形成双链核酸。由于双链核酸不能被GO吸附,荧光不被猝灭,信号较强。在该体系中,FAM与ROX的最大激发波长与最大发射波长间的间隔很近,在通过同步荧光进行分析时,两种染料的荧光信号可同时获得,即可利用双色荧光法对汞进行定量检测。在优化条件下,Hg2+浓度在8×10-10-8×10-8 mol·L-1的范围内,FAM与ROX总的荧光强度与Hg2+的浓度之间具有良好的线性关系,检测限为5×10-10 mol·L-1。这种方法可识别样品中能与探针反应的核酸所产生的假阳性信号,进一步提高了土壤样品中汞分析的选择性。4、在双色荧光分析法检测土壤汞的基础上,利用两条部分互补的富含T碱基的单链核酸(其中一条用染料ROX标记),结合氧化石墨烯及核酸染料SYBR GreenⅠ,采用同步荧光分析法,建立一种灵敏度更高,检测限更低的Hg2+双色荧光定量检测方法。没有Hg2+时,两条单链核酸中有多个T-T错配碱基,不能形成双螺旋结构,核酸染料SYBR GreenⅠ与核酸的作用很弱,荧光信号不强;加入氧化石墨烯时,两种单链DNA均被氧化石墨烯吸附,荧光染料ROX的荧光被猝灭,荧光信号也很弱。有Hg2+时,两条单链核酸通过“T-Hg2+-T”特异性结合形成双螺旋结构,与SYBR GreenⅠ的作用增强,SYBR GreenⅠ的荧光信号显著增强;加入氧化石墨烯时,双链核酸不能被氧化石墨烯吸附,ROX的荧光不能被猝灭,因此其荧光信号也会显著增强。在优化条件下,Hg2+浓度在5×10-10-500×10-10 mol·L-1之间时,SYBR GreenⅠ及Carboxy-X-rhodamine(ROX)总的荧光强度(?IT)与Hg2+浓度(C)之间具有良好的线性关系,方法检测限(3σ)为2×10-10 mol·L-1。该方法利用核酸染料SYBR GreenⅠ灵敏度高的特点,结合ROX标记单链核酸,既可利用双色信号识别样品中的假阳性信号,又可显著提高检测方法的灵敏度,降低方法的检测限。上述四种方法均成功实现了对土壤实际样品的检测。第一种检测方法主要优点在于检测成本低,适用于汞含量较高的土壤样品的分析。第二种定量检测方法最主要的优点在于操作简单,灵敏度高,检出限低,适合土壤痕量汞的分析。第三种定量检测方法的优点在于能够识别样品中能与探针反应的核酸所产生的假阳性信号,显著提高检测的选择性,适合检测汞含量中等的土壤样品。第四种定量检测方法既能识别样品中能与探针反应的核酸所产生的假阳性信号,又能显著提高检测灵敏度,降低检出限,适于低浓度汞污染土壤的检测。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X833
【部分图文】：
检测原理图
2-2b）；当溶液中同时存在分子信标、单链核酸及 Hg2＋时，Hoechs度显著增强，目标 Hg2＋浓度不同，其荧光强度存在明显的差别，且移至 460 nm 处（图 2-2c,d）。由此说明利用上述原理检测 Hg2＋是可
冲溶液对测定结果的影响。结果（图 2-3）表明，在 pH 7.0-9.0 的范Hoechst 33258 的荧光强度随 pH 的增加而增强，在 pH 8.2 时达到 增加而减弱。这主要有两个原因，一是双链的形成在 pH 略偏碱是荧光染料Hoechst 33258在碱性条件下荧光信号较强 (Xiang et a 2011)。这一结果与文献报道较接近，因此后续实验中选择缓冲溶液
【参考文献】
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本文编号：
2850776
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