白腐真菌强化处理铅污染农业废物及其对铅的抗性机理研究

发布时间：2020-10-23 19:21

　　 我国是一个农业大国,农业资源产量丰富。但工业的快速发展和化肥的广泛使用致使农业废物中重金属污染日益严重,而传统堆肥法对农业废物的利用效率低、堆制时间长,且重金属的存在将影响堆肥过程中微生物的活性,降低堆肥效率,并造成堆肥成品中重金属毒性超标,导致堆肥品质低下。为了解决上述问题,本文较系统地开展了接种白腐真菌强化处理含重金属铅污染农业废物的研究,明确了白腐真菌处理铅污染农业废物的应用潜力,初步揭示了其强化农业废物降解和钝化重金属的作用机理;在此基础上,为了探讨白腐真菌抵抗重金属毒性的内在机制,本文还开展了白腐真菌典型菌种黄孢原毛平革菌在重金属铅胁迫下的氧化损伤效应研究、生理响应机制研究和基因差异表达研究,将为提高微生物修复技术治理重金属污染的效果提供理论指导。本文的具体研究工作及成果包括以下5个部分的内容:第1部分为白腐真菌强化堆肥处理铅污染农业废物及微生物群落响应研究。该部分考察了接种黄孢原毛平革菌堆肥处理铅污染农业废物过程中的微生物群落变化和铅的化学形态转化。研究表明,铅胁迫显著影响了农业废物堆肥过程中微生物物种多样性和丰富度,而接种黄孢原毛平革菌有助于铅的钝化、降低其毒性,从而减轻对微生物的毒性;冗余分析显示碳氮比(C/N)、总有机质、温度和可交换态铅为驱动细菌群落结构变化的显著性影响因子;皮尔森相关分析显示,总有机碳(TOC)和C/N显著影响了堆肥过程中铅的化学形态分布,表明农业废物堆肥过程中铅的稳定化是伴随着农业废物的降解而进行的,堆肥是一种潜在的修复重金属铅污染的方法。第2部分为白腐真菌强化固态发酵处理铅污染农业废物及其对铅的稳定化机理研究。本研究构建了以农业废物稻草秸秆为单一底物、黄孢原毛平革菌为接种菌剂的固态发酵体系,并考察了固态发酵过程中有机质含量、真菌生物量、木质素降解酶活性和草酸含量的变化,同时评估了铅的浸出毒性变化和化学形态转化,并分析了草酸含量与铅浸出毒性的相关性。研究发现,100~200 mg kg~(–1)的铅显著诱导了有机质的降解,而400 mg kg~(–1)的铅则对其有抑制作用,与此类似,100~200mg kg~(–1)的铅显著提高了发酵前期木质素过氧化物酶(Li P)和锰过氧化物酶(Mn P)酶活性,也间接证实了Li P和Mn P在有机质降解过程中的重要作用。此外铅胁迫显著抑制了发酵前期真菌的生长而后期无明显影响,表明黄孢原毛平革菌具有铅防御能力,缓解其毒性,并逐渐适应含铅的环境。此外,黄孢原毛平革菌在铅胁迫前期能分泌高含量的草酸螯合铅离子或转化为更加稳定的形态,降低铅的浸出毒性,而后期铅的稳定可能与腐殖酸类物质的形成积累有关,X射线衍射分析证实了发酵末期草酸铅和磷氯铅矿的存在,表明接种黄孢原毛平革菌固态发酵处理铅污染农业废物是一种有效的同时处理农业废物和稳定化铅的方法。第3部分为铅胁迫对黄孢原毛平革菌的氧化损伤效应研究。本研究采用单细胞凝胶电泳考察了铅胁迫对黄孢原毛平革菌的DNA损伤,同时兼顾考察了铅胁迫对黄孢原毛平革菌质膜过氧化程度和胞内活性氧自由基含量的影响。研究结果发现,铅胁迫降低了胞内O_2~(?–)的含量,这可能是因为黄孢原毛平革菌启动了抗氧化防御机制,分泌了超氧化物歧化酶等抗氧化剂;此外,短时间(8 h以内)的铅胁迫诱导了胞内H_2O_2和?OH的产生和积累,促进了细胞质膜的过氧化作用,而铅胁迫24 h后,除了400 mg L~(–1)铅胁迫的实验组,其他实验组的黄孢原毛平革菌通过自身的抗氧化机制已经基本清除了细胞内的活性氧,达到了氧化–抗氧化平衡。彗星实验结果表明,铅对黄孢原毛平革菌细胞的DNA损伤呈现明显的剂量效应。皮尔森相关性分析表明,当黄孢原毛平革菌受到铅胁迫时,细胞内的活性氧会发生相应的变化,使细胞处于氧化应激状态,引发细胞质膜的过氧化,造成细胞的DNA损伤。第4部分为黄孢原毛平革菌对铅胁迫的生理响应机制研究。本研究考察了重金属铅胁迫对黄孢原毛平革菌生长、氧化压力和抗氧化剂的影响,以及黄孢原毛平革菌对铅的吸附及积累特性,分析了黄孢原毛平革菌胞内铅积累量与生物量、氧化压力和抗氧化剂的相关性。研究结果发现,黄孢原毛平革菌对低浓度(200mg L~(–1))的铅具有很好的耐受能力,并能够通过细胞外吸附和细胞内积累有效的去除溶液中的铅离子。但是,铅胁迫诱导了黄孢原毛平革菌胞内H_2O_2的积累,并引发了脂质过氧化作用,从而造成了对黄孢原毛平革菌细胞的氧化损伤。超氧化物歧化酶(SOD)活性的上调和过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性的下调促进了H_2O_2的积累,细胞内非酶类抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)的合成缓解了铅的毒性。以上研究结果表明黄孢原毛平革菌对铅具有良好的耐受能力和抗氧化防御能力。第5部分为黄孢原毛平革菌对铅胁迫的基因差异表达研究。为了从基因水平上阐明黄孢原毛平革菌耐重金属胁迫的内在机制,本研究采用c DNA-AFLP技术考察了黄孢原毛平革菌在铅胁迫下的基因表达差异,实验共观察到了约300个差异表达片段,经回收、克隆和测序,最后筛选得到了43个有效的差异表达片段。通过Blast2GO软件对差异表达片段序列进行BLASTX同源性分析和GO功能注释,其中23个序列与已知功能的基因具有较高的同源性,其余20个TDFs与已知功能基因的同源性较低或无任何同源性,可能是新的铅应答基因。GO功能注释分析表明,不同铅胁迫时间下,应答基因主要涉及离子结合(23%),能量代谢(12%)和信号传导(12%)等,而不同的铅浓度胁迫下,应答基因主要涉及离子结合(30%)和能量代谢(20%)。q RT-PCR的研究结果与c DNA-AFLP的表达谱特征基本一致,证实了c DNA-AFLP是一种重复率高、假阳性低,适合基因差异表达研究的有效手段。本文明确了白腐真菌强化堆肥和固态发酵处理重金属铅污染农业废物的可行性,并在一定程度上揭示了白腐真菌强化降解农业废物和稳定化重金属的作用机制,为重金属污染农业废物的处理提供了一种思路;此外明确了黄孢原毛平革菌对重金属铅胁迫的生理响应机制和基因表达差异,可为提高其对重金属的处理能力提供理论指导。
【学位单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：X71;X172
【部分图文】：

白腐真菌强化处理铅污染农业废物及其对铅的抗性机理研究有效的降解。由于白腐真菌生物降解规律和降解机制的独特性，引发了对与其降解活动相关的生物学、生物化学及分子生物学等相关方面的深入研究。1.3.2.1 木质纤维素废物的结构和化学组成木质纤维素由木质素（芳族聚合物）、碳水化合物（如纤维素和半纤维素）、果胶（杂多糖）、蛋白质、灰分、盐和矿物质组成，不同生物质其成分和各成分比例各不相同。每层植物细胞壁含有纤维素、半纤维素和木质素，但次级壁的 S2层特别富含纤维素，而中间层具有最高的木质素含量[55]。木质纤维素生物质的各组分构成如图 1.1 所示。

图 1.2 锰过氧化物酶的催化循环过程Figure 1.2 The catalytic cycle of manganese peroxidase (MnP)[62, 6真菌强化木质纤维素降解的研究进展腐真菌对底物的降解过程具有非专一性、非水解性和细胞素、半纤维素及其他一系列有机污染物都具有较强的降解的典型菌种黄孢原毛平革菌，目前已研究证实其对木质素、农药以及多环芳族化合物等都具有较好的降解能力。其降解农业废物，促进农业废物的资源化利用，同时减少环究者们广泛关注的热点[68-73]。il 等人[74]开展了利用白腐真菌处理秸秆的研究，结果发现种白腐真菌大都表现出对秸秆较强的降解能力，可使木质%，纤维素和半纤维素降解率达到 20%~40%，干物质损失 等[75]研究发现白腐真菌在强化处理麦秸木质素过程中，对择性降解作用，其木质素降解率达到 59%~90%。杭怡琼

金属降低其毒性的作用机理；在此基础上，研究白腐真菌与重金属铅的交互作用，探究白腐真菌在铅胁迫下的氧化损伤机制与抗氧化防御机制，并采用分子生物学手段上研究白腐真菌对铅胁迫的基因表达差异。本文的研究框架如图1.3所示，围绕这一研究框架主要开展以下5个方面工作：（1）考察接种黄孢原毛平革菌对铅污染农业废物堆肥过程中微生物群落以及铅的毒性的影响。研究主要包括考察该过程中铅的化学形态转化并分析它与堆肥理化参数的相关性，通过PCR-DGGE技术以及热图和聚类分析揭示该过程中的微生物群落演替特性，采用冗余分析（RDA）阐明堆肥理化因子与微生物群落的相关性，并使用方差分离分析揭示影响微生物群落演替的显著性影响因子。（2）以稻草秸秆为唯一底物，开展接种黄孢原毛平革菌强化固态发酵处理铅污染农业废物及铅的稳定化研究。研究主要包括考察固态发酵过程中有机质含量、真菌生物量、木质素降解酶活性和草酸含量的变化，评估固态发酵过程中铅的浸出毒性变化和化学形态转化，分析草酸含量与铅浸出毒性的相关性，揭示黄孢原毛平革菌固态发酵降解铅污染农业废物的过程机理
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