邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯降解菌的分离及降解机理研究

发布时间：2020-10-30 10:47

　　 酞酸酯(Phthalate acid esters,PAEs)是一类典型的难降解有机污染物,具有内分泌干扰特性。本文从选育高效降解邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(Di-(2-ethylehxyl)phthalate,DEHP)的微生物入手,从近海岸潮间带塑料制品污染的底泥中筛选出一株DEHP高效降解菌YC-YT1,对其降解DEHP的生物降解特性进行了研究;通过全基因组测序获得了菌株YC-YT1完整的遗传信息,利用比较基因组学和生物信息学预测并获取了降解相关的基因;借助传统分子生物学技术结合物质代谢途径分析,对相关降解酶进行功能验证。本论文研究成果如下:(1)从近海岸潮间带塑料制品污染的底泥中筛选出一株DEHP高效降解菌YC-YT1,经鉴定为赤红球菌(Rhodococcus ruber)。该菌株能在72小时内完全降解100 mg/L DEHP,并且可高效降解13种不同类型的酞酸酯化合物和多种芳香族化合物;此外,YC-YT1能有效降解低浓度的DEHP,是现今已报道的DEHP降解菌中底物谱最宽、低浓度DEHP利用率最高的赤红球菌,为环境修复酞酸酯污染物储备了降解菌资源;(2)菌株YC-YT1在不同环境条件下降解DEHP能力的单因素研究,结果表明YC-YT1对温度、pH和盐离子浓度都拥有较高的耐受度,菌株的接种量对降解能力无明显影响,添加一定量的葡萄糖可明显提升菌株的降解能力;采用响应面法对有显著影响的单因素进行了组合优化,菌株最优降解条件为额外添加5.0 g/L葡萄糖,pH 7.5,温度33℃;(3)液相/质谱分析检测了菌株YC-YT1降解DEHP过程中的中间产物,DEHP首先降解生成邻苯二甲酸单(2-乙基己)酯(MEHP),继而生成邻苯二甲酸再进一步进入三羧酸循环。此外,菌株YC-YT1通过调整其细胞表面疏水性(Cell surface hydrophobicity,CSH)获取了良好的环境适应能力,可修复79.7%-95.9%的污染土壤和水体,在生物修复被DEHP污染的盐碱性环境上具有巨大的应用潜能。(4)利用Pac Boi三代测序平台对菌株YC-YT1进行了全基因组测序,序列提交至Gen Bank(CP023712)。菌株YC-YT1包括一个环状基因组(5.66 Mb,GC含量70.41%)和两个质粒(plasmid01,159 Kb,GC含量67.2%;plasmid02,77 Kb,GC含量64.92%),共预测到5525个CDS,其中5375个CDS被注释到公共数据库(97%);通过同源比对结合比较基因组学分析,挖掘参与DEHP降解的基因和基因簇,详细分析了酞酸酯双加氧酶基因和苯环双加氧酶基因,涉及联苯、邻苯二酚、原儿茶酸、苯甲酸和邻苯二甲酸等物质的降解;获得了两个参与DEHP降解的新型酯酶基因Dehp1199和Mehp4077,并对Dehp1199基因进行了功能验证和酶学特征分析,发现Dehp1199酯酶比现今已报道的DEHP降解酶有较宽的p H和温度适应范围、更好的稳定耐受力,为DEHP降解酶的开发,改造提供了重要资源。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X172;X592
【部分图文】：

图 1.1 邻苯二甲酸酯的化学结构Figure 1.1 The chemical structureof表 1.1 典型的邻苯二甲酸酯Table 1.1 Typicalphthalateacid 英文名称 DimethylPhthalate DiethylPhthalate DipropylPhthalate DiisobutylPhthalate Di-n-butylPhthalate Di-n-pentylPhthalate Dihexyl Phthalate ButylbenzylPhthalate Di(2-ethylhexyl) Phthalate Di-n-octylPhthalate

2 酞酸酯化合物的危害及管控长期以来，PAEs 作为增塑剂的塑料制品，因制造成本低，综合理化不受限制地生产和应用(曾锋等，1999)。然而上个世纪 70 年代，在人s(Oakley et al., 1973)，学者们就 PAEs 的毒性和致癌问题开始了激烈的酞酸酯具有高毒性、致畸性、致癌性和致突变性以及生殖毒性(Liang即使微量的 PAEs 仍可扰乱动物的多种内分泌生化效应，因此将其归ang et al., 2013; Benson R, 2009)。陈荣圻研究显示，尽管 DEHP 的急量（LD50）大于 25 g/kg，Ames 试验阴性，但大剂量作用下表现出较2016)。酞酸酯是一类全球广泛使用的污染物之一，1995 年世界卫生组染物是一类需要必须被控制使用的化合物(Xiao et al., 2014)，世界野环境激素名单(孙增荣，2010)，可见 PAEs 已被世界内多数国家列为存在的潜在风险极度关注（priority pollutant）(Chao et al., 2006)。其中邻二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）、邻苯二二甲酸二正辛酯（DOP）等 6 种邻苯二甲酸酯被美国 EPA 列为优先控如图 1.2，部分 PAEs 的毒性数据见表 1.5。

图 1.3 增塑剂 DEHP 毒性效应及其机制示意图Figure 1.3 The schematic of thetoxicity effect of plasticizer DEHPand itsmechanism典型酞酸酯 DEHP 概述苯二甲酸二（2-乙基己）酯（Di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP），化学式为 C6H4(CO2C8H子质量 390.6，比例最高可达 60-70% (Wang et al., 2015; Xia et al., 2011)。DEHP 是最 PAEs 化合物，也是使用最广和产量最大的塑化剂，其化学结构式为：图 1.4 DEHP 的化学结构式Figure 1.4 The chemical structureof DEHPEHP 被广泛使用的原因在于其综合性能良好，如增塑效率高，柔韧度好，耐热性良好
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本文编号：2862367