几种耐盐植物中黄酮化合物的大孔树脂分离及抑藻活性评价

发布时间：2020-11-04 07:33

　　 赤潮是一种世界性海洋灾难,严重影响海洋生态环境和海洋渔业,给人体健康带来严重的威胁。因此,寻找有效的预防与治疗赤潮的措施是亟需解决的重要海洋环境问题。近年来,植物化感作用在防治赤潮方面展现出良好的应用前景,为寻找高效、环境友好的抑藻方法提供了新的思路。为增强抗逆性,耐盐植物常含有特殊的化学成分以增强环境适应能力,是寻找抑藻化感物质的重要资源。黄酮化合物是一类广泛存在于植物中的化感物质,其抑藻化感作用近年来逐渐引起人们的重视。因此,研究规模化制备黄酮化合物的方法尤为重要。本论文寻找到能用于不同植物中黄酮化合物分离的大孔树脂,对黄酮化合物在大孔树脂上的吸附行为进行了研究,并建立了大孔树脂纯化几种耐盐植物中黄酮化合物的工艺路线。最后,对分离的黄酮化合物进行抑藻活性评价,为寻找环境友好型天然抑藻剂提供依据,也为耐盐植物在赤潮防治方面的资源应用提供理论基础。具体研究结果如下:1.大孔树脂的筛选及吸附行为研究。选择黄酮含量高、所含黄酮结构明确的山楂叶为模型植物,筛选了对植物中黄酮化合物具有较好吸附及解吸性能的大孔树脂HPD-300和HPD-400。树脂的比表面积越大,吸附能力越强;树脂孔径越小,吸附能力越强。通过扫描电镜对吸附前后的大孔树脂微观结构进行观察,发现HPD-300和HPD-400树脂吸附样品前表面为粗糙的多孔结构,吸附后变得平整光滑,更加致密,说明其多孔的表面有利于吸附。使用红外光谱对吸附山楂叶提取物前后的树脂结构进行了表征,可明显看到样品已被树脂吸附,但树脂的官能团吸收峰未见明显变化,说明样品不是通过化学反应与树脂结合。吸附动力学研究表明,HPD-400树脂对山楂叶总黄酮的吸附速率比HPD-300树脂快,说明黄酮化合物在树脂孔径内部扩散时受到阻力不同,孔径大的树脂阻力较小,吸附速率较快。山楂叶总黄酮在两种树脂上的吸附动力学数据均符合准二级动力学模型,吸附过程除了受颗粒内扩散过程的控制外,还可能受液膜扩散过程的影响。吸附热力学实验结果表明,Langmuir吸附等温线模型可以更好地描述山楂叶总黄酮在HPD-300树脂上的吸附行为,说明山楂叶总黄酮在HPD-300树脂上的吸附为单分子层吸附,且为放热、自发的物理过程。优化了HPD-300树脂纯化山楂叶总黄酮的工艺条件。经HPD-300树脂纯化后,山楂叶总黄酮含量由23.75%增加到58.05%,回收率为81.88%。建立了HPD-400树脂-制备HPLC技术纯化山楂叶中牡荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷的工艺路线。经树脂分离后,两种化合物的含量分别从0.720%和2.63%提高到6.08%和22.2%,回收率分别为79.1%和81.2%。经制备HPLC分离后,得到纯度大于96%的牡荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷单体。2.HPD-300树脂分离大叶白麻叶黄酮化合物的研究。以耐盐植物大叶白麻为研究对象,对模型植物的树脂筛选结果进行了验证,HPD-300树脂对耐盐植物中黄酮化合物也具有最好的静态吸附能力,进一步说明比表面积是影响树脂吸附能力的重要因素。黄酮化合物在树脂上的吸附量主要与其在植物中的含量有关,含量越高,吸附量越大。不同结构的黄酮在不同性质树脂上的相对吸附能力(吸附率)顺序一致,主要与黄酮化合物结构有关(包括苷元的结构及所含糖基的个数等)。苷元上羟基数目对黄酮化合物在树脂上吸附率影响较大,说明黄酮化合物主要通过疏水性苷元与树脂的聚苯乙烯骨架结合。另外,所有测试树脂对绿原酸吸附能力均较差,吸附率低于10%,说明黄酮苷元芳香环与树脂苯环间可能还通过π-π相互作用结合。利用HPD-300树脂—Sephadex LH-20柱层析联用建立了大叶白麻叶中白麻苷和异槲皮苷分离的工艺路线。经树脂纯化后,白麻苷的含量从2.16%提高到21.34%,异槲皮苷的含量从1.26%提高到10.70%,收率分别为82.1%和77.3%。树脂纯化后的产物,经Sephadex LH-20柱层析分离后,得到纯度分别为93.5%和97.6%的白麻苷和异槲皮苷。吸附动力学实验表明,两种化合物在HPD-300树脂上的吸附过程均符合准二级动力学模型。颗粒内扩散模型拟合结果显示吸附速率可能由颗粒内扩散和液膜扩散共同控制。热力学实验结果显示,Langmuir吸附等温线模型能较好地描述两种化合物的吸附行为。HPD-300树脂对两种黄酮苷的吸附为单分子层吸附,是自发的物理吸附过程。上述实验结果说明HPD-300树脂对耐盐植物中黄酮化合物也具有较好的分离效果。3.HPD-300树脂在柽柳枝叶和荷叶中黄酮化合物分离中的应用。通过HPLC-MS技术首次发现典型耐盐植物柽柳枝叶中含有多种黄酮硫酸酯类化合物。利用酸提-HPD-300树脂—硅胶柱色谱联用技术,优化了山奈甲黄素和槲皮素-3′,4′-二甲醚的分离工艺,得到纯度高于97%的两种单体化合物。实验结果表明,HPD-300树脂既适合分离黄酮苷类化合物,也可用于游离黄酮化合物的分离。利用HPD-300树脂-硅胶柱色谱联用建立了湿地植物荷叶中的槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的分离工艺,可得到纯度大于97%的单体化合物,进一步证实HPD-300树脂适用于分离不同植物中的黄酮化合物。4.黄酮化合物的抑藻活性评价。中肋骨条藻是我国近海岸爆发频率较高的典型赤潮藻,论文评价了分离的黄酮化合物对中肋骨条藻生长的抑制作用。结果表明,柽柳枝叶中的山奈甲黄素具有最强的抑制作用,培养3 d后EC_(50)为16.70μM。槲皮素-3′,4′-二甲醚的抑藻作用相对较弱,EC_(50)为99.76μM,可能与其在海水中溶解度较差有关。槲皮素及其氧苷衍生物白麻苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷也有较强的抑制作用,培养3 d后的EC_(50)分别为35.56μM、19.98μM、24.16μM和34.18μM。其中,异槲皮苷、白麻苷和山奈甲黄素和的抑藻活性强于阳性对照硫酸铜。两种黄酮碳苷化合物牡荆素葡萄糖苷和牡荆素鼠李糖苷表现出微弱的抑藻活性,最高浓度下抑制率仅为30%-40%左右。上述实验结果表明,树脂比表面积和孔径对吸附能力影响较大,树脂主要吸附黄酮化合物的疏水性母核,黄酮苷元与树脂苯环之间的π-π相互作用对吸附也有一定贡献。筛选的HPD-300树脂适合分离不同植物中的黄酮化合物,黄酮化合物在HPD-300树脂上的吸附动力学符合准二级动力学方程,吸附速率受到颗粒内扩散和液膜扩散的控制。黄酮化合物在HPD-300树脂上的吸附为放热、自发的单分子层物理吸附。利用大孔树脂HPD-300建立的黄酮分离工艺路线可靠、简便、环保、价廉,为其他植物中黄酮化合物的大孔树脂分离提供了依据。从耐盐植物大叶白麻叶和柽柳枝叶中分离的黄酮化合物具有显著抑制赤潮藻中肋骨条藻生长的作用,有望开发成为环境友好型的抑藻剂。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：X55
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 文献综述
    1.1 赤潮的危害与防治
        1.1.1 赤潮的危害
        1.1.2 赤潮的防治
    1.2 植物抑藻化感作用研究进展
        1.2.1 具有抑藻化感作用的植物
        1.2.2 抑藻化感物质研究进展
    1.3 化感物质黄酮化合物的抑藻活性、药理作用及提取分离方法研究进展
        1.3.1 黄酮化合物的抑藻化感作用
        1.3.2 黄酮化合物的药理活性
        1.3.3 黄酮化合物的提取方法
        1.3.4 黄酮化合物的分离方法
        1.3.5 大孔吸附树脂概况
        1.3.6 大孔吸附树脂在黄酮类化合物分离纯化中的应用进展
    1.4 课题研究目标和内容
        1.4.1 研究目标
        1.4.2 研究内容
第2章 大孔树脂的筛选及对黄酮化合物的吸附行为研究
    2.1 仪器与材料
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 材料与试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 大孔吸附树脂的预处理
        2.2.2 山楂叶提取物溶液的配制
        2.2.3 总黄酮含量的测定
        2.2.4 液相色谱与液质联用分析条件
        2.2.5 VOG和VOR的含量测定方法
        2.2.6 静态吸附解吸实验
        2.2.7 静态吸附动力学实验
        2.2.8 静态吸附等温线的测定
        2.2.9 吸附热力学参数计算
        2.2.10 动态吸附解吸实验
        2.2.11 红外光谱测定
        2.2.12 扫描电镜测定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 山楂叶提取物中黄酮化合物的结构分析
        2.3.2 大孔树脂的静态吸附/解吸能力
        2.3.3 吸附前后大孔吸附树脂微观形态的变化
        2.3.4 吸附前后大孔树脂结构的红外光谱表征
        2.3.5 HPD-300树脂分离HFL的研究
        2.3.6 HPD-400树脂分离山楂叶提取物中VOG和VOR的研究
    2.4 结论
第3章 HPD-300树脂对大叶白麻叶中黄酮化合物的分离效果研究
    3.1 仪器与材料
        3.1.1 实验仪器
        3.1.2 材料与试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 大叶白麻叶的提取和样品溶液的配制
        3.2.2 液相色谱分析条件
        3.2.3 液质联用分析条件
        3.2.4 各化合物标准曲线的绘制
        3.2.5 静态吸附解吸实验
        3.2.6 静态吸附动力学实验
        3.2.7 静态吸附等温线的测定
        3.2.8 动态吸附解吸实验
        3.2.9 QOS和ISO的凝胶柱色谱分离
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 大叶白麻叶提取物中所含化学成分的结构分析
        3.3.2 QOS和ISO在大孔树脂上的静态吸附/解吸能力
        3.3.3 黄酮化合物结构对吸附能力和吸附率的影响
        3.3.4 吸附动力学研究
        3.3.5 吸附等温线研究
        3.3.6 吸附热力学参数
        3.3.7 上样浓度的影响
        3.3.8 泄漏曲线
        3.3.9 洗脱曲线
        3.3.10 产物分析
        3.3.11 QOS和ISO的凝胶柱色谱分离
        3.3.12 化合物的结构鉴定
    3.4 结论
第4章 HPD-300树脂在柽柳枝叶黄酮化合物分离中的应用
    4.1 仪器与材料
        4.1.1 实验仪器
        4.1.2 材料与试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 柽柳枝叶的提取
        4.2.2 柽柳枝叶提取物色谱及液质联用分析条件
        4.2.3 柽柳枝叶的酸提取
        4.2.4 QDM和MK的含量测定
        4.2.5 QDM和MK的HPD-300树脂分离
        4.2.6 QDM和MK的硅胶柱色谱分离
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 柽柳枝叶提取物中黄酮化合物的结构分析
        4.3.2 柽柳枝叶酸提物中黄酮化合物的结构分析
        4.3.3 QDM和MK在HPD-300树脂上的泄漏曲线
        4.3.4 QDM和MK在HPD-300树脂上的洗脱曲线
        4.3.5 QDM和MK的硅胶柱色谱分离
        4.3.6 化合物的结构鉴定
    4.4 结论
第5章 HPD-300树脂在荷叶黄酮化合物分离中的应用
    5.1 仪器与材料
        5.1.1 实验仪器
        5.1.2 材料与试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 荷叶的提取
        5.2.2 总黄酮的含量测定
        5.2.3 荷叶提取物HPLC分析色谱条件
        5.2.4 动态吸附解吸实验
        5.2.5 化合物1的硅胶柱色谱分离
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 泄漏曲线
        5.3.2 洗脱曲线
        5.3.3 产物分析
        5.3.4 化合物1的硅胶柱色谱分离
        5.3.5 化合物1的结构鉴定
    5.4 结论
第6章 黄酮化合物的抑藻化感作用评价
    6.1 仪器与材料
        6.1.1 实验仪器
        6.1.2 材料与试剂
    6.2 实验方法
        6.2.1 藻种的培养
        6.2.2 抑藻化感能力测试
        6.2.3 数据处理
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 黄酮化合物对中肋骨条藻的抑藻化感作用评价
        6.3.2 不同黄酮化合物抑制中肋骨条藻生长的半效应浓度（EC50）
        6.3.3 B环取代基对游离黄酮抑藻化感能力的影响
        6.3.4 糖基对抑藻化感能力的影响
        6.3.5 苷原子的类型对抑藻化感能力的影响
    6.4 结论
第7章 结论与展望
    7.1 主要结论
    7.2 创新点
    7.3 展望
参考文献
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

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