利用组学方法分析嗜热链霉菌高效降解转化生物质废弃物的分子机制

发布时间：2020-11-07 09:30

　　 进入21世纪,资源与环境成为影响人类可持续发展的突出问题。特别是生物工业技术产业形成高附加值产品的同时会产生大量生物质废弃物,其化学成分复杂,有的存在大量抗生素等环境有害物质,因此如何高效、高值转化生物质废弃物就成为当前生物技术领域研究的热点问题。微生物在生物质废弃物的降解过程中发挥了重要作用,全面系统地筛选、认识并改造相关微生物已成为研究重点。本研究从天然生境中筛选获得一系列高温放线菌株。利用整合功能组学方法研究了嗜热链霉菌F-3对生物质废弃物的降解偏好性,明确了其在菌渣等危险生物质废弃物转化过程中的重要作用。为了深入研究功能酶系的作用,克隆表达了该菌6个高温、耐碱的几丁质酶组分,利用结构信息组学技术揭示了相关酶系高效协同降解的分子机制;并对其中关键的持续性几丁质酶SsChi18A的活性架构进行了系统功能分析,初步阐明其高效持续性作用的分子机制。相关研究为工业微生物发酵菌渣等生物质废弃物的高效高值转化等奠定了理论基础。本文取得如下研究成果:1.从生物质废弃物降解生境中筛选获得一系列具有高效降解活性的嗜热放线菌菌株。微生物在生物质废弃物的转化过程中发挥了重要作用。玉米秸秆混合牛粪降解生境中含有丰富的微生物群落,利用宏基因组及宏蛋白质组分析表明,高温放线菌在其中占据重要地位。经过对生境样品的筛选和纯化,共获得8株生物质废弃物降解相关的嗜热放线菌,分别来自诺卡氏菌属、拟诺卡氏菌属、链霉菌属以及喜热裂孢菌属,相关菌株的获得为后继研究奠定了物质基础。2.利用整合功能组学方法分析了嗜热链霉菌F-3对生物质废弃物的降解偏好性。嗜热链霉菌F-3菌株筛选自天然高温生物质降解生境,其最适生长温度为50℃。全基因组测序表明,其基因组中含有多种与有机废弃物降解代谢相关的功能基因和与次级代谢产物合成相关的基因簇。其中编码木质纤维素降解相关酶类基因有18种,几丁质降解相关基因有9种,还有71种蛋白酶编码基因等,这表明其在生物质废弃物的降解过程有较大潜力。利用多种不同碳源对其进行培养,并对其胞外功能酶系的种类、浓度等动态变化进行系统分析,结果表明胞外酶系中几丁质酶类及β-1,3-葡聚糖酶高效诱导表达;木质纤维素降解酶类分泌量低,同时胞外还检测到了大量蛋白酶类表达,特别是在发酵后期表达量明显升高,因此链霉菌F-3应在天然生境中的生态位应该是真菌等残余菌体的高效降解利用者。链霉菌F-3降解偏好性的阐明,有助于指导其工业应用方向。3.以3种工业微生物发酵菌渣为底物,利用功能蛋白质组学分析证明了嗜热链霉菌F-3通过分泌多种类和多组分降解酶对生物质废弃物进行降解转化。以工业生产中微生物发酵剩余的黑曲霉菌渣、酵母菌菌渣及产大观霉素的链霉菌菌渣等生物质废弃物为底物,分析了链霉菌F-3在菌渣降解过程中,功能酶系的变化规律。结果表明,链霉菌F-3可直接利用相关菌渣生长,未受废弃物中残余抗生素等物质抑制。三种菌渣的发酵液中均检测到4种几丁质水解酶、2种几丁质氧化酶以及3种β-1,3-葡聚糖酶组分;这些水解酶来自不同的家族,具有不同的结构域组成。此外,在大观霉素菌渣中检测到3种β-N-乙酰己糖苷酶,这些酶组分应参与真菌细胞壁多糖的高效降解转化。蛋白质组还检测到14种胞外蛋白酶以及40种胞内蛋白酶的表达,其中S8家族的内切丝氨酸蛋白酶在胞外表达量最高;且5种S8家族蛋白酶活性架构具有不同分子表面性质,其精确识别与结合可高效协同降解蛋白质形成肽片段;另外,胞外还存在大量金属蛋白酶,可与内切丝氨酸蛋白酶及外切氨肽酶协同降解肽段片段形成小肽及部分氨基酸。大量肽转运蛋白的确定证实了该链霉菌可吸收相关肽段,并通过胞内氨肽酶及头羧肽酶高效协同的方式快速降解转化相关肽类。链霉菌F-3对工业生物质废弃物高效降解利用的潜能分析为其进一步开发利用奠定了理论基础。4.从链霉菌F-3基因组中克隆表达了 6种高温、耐碱的几丁质酶组分,并利用结构信息学技术揭示了相关酶系高效协同降解的分子机制。几丁质是类似结晶纤维素的一类难降解生物质。嗜热链霉菌F-3具有耐高温耐碱性的几丁质降解活性,对其中6种几丁质降解相关酶组分进行了异源表达,包括3种来自GH18家族几丁质酶(SsChi18A,SsChi18B和SsChil8C),1种GH19家族的几丁质酶(SsChi19A),1种GH20家族的β-N-乙酰己糖胺酶(SsGH20A)和1种来自AA10家族的裂解多糖单加氧酶(SsLPMO10A)。生化测定结果表明这些水解酶都可耐受70℃的高温,并且在pH值为4至1 1时酶活相对稳定。产物谱分析表明这些几丁质降解酶具有不同的降解模式,在几丁质降解过程中显示明显的协同效应。基于结构生物信息学分析,GH18几丁质酶组分不同作用模式可能是由其活性架构中的Loop差异引起的。其中,SsChi18A是持续性几丁质酶,主要作用于不溶性几丁质;而SsChi18B和SsChil8C是内切非持续性酶类,对几丁质寡糖的降解显示出更高活性。此外,蛋白质组学及协同分析也表明氧化酶类SsLPMO10A的重要性,它可增强水解酶降解活性。总的来说,通过对菌株F-3分泌的多种几丁质降解酶的功能和生物信息学分析,阐明了其协同高效降解不溶性底物的物质和结构基础,将为天然几丁质的高效工业化转化准备了功能基因素材。5.通过链霉菌F-3几丁质酶系中关键持续性几丁质酶SsChi18A的活性架构分析,初步阐明其高效持续性作用的分子机制。酶分子的持续性是不溶性结晶底物高效降解的主要保证,因此持续性几丁质酶在结晶几丁质的高效降解过程发挥了重要作用。序列及结构生物信息学分析表明,持续性酶活性架构中含有多个保守芳香族氨基酸与带电氨基酸,芳香族氨基酸已被证明与酶分子持续性相关。因此,利用丙氨酸筛选方法探究带电氨基酸残基在酶分子结合与持续性催化过程中的作用,结果表明,与芳香族氨基酸类似,活性架构中远端带电氨基酸的突变对酶分子催化影响较小:而催化位点附近的氨基酸残基突变会造成酶分子活力的明显变化。特别是将与+1位点具有相互作用的R264突变为丙氨酸后,突变体对不溶性底物的降解酶活明显升高,提高了 1.2倍,而对可溶性底物的酶活下降。除了R264A外,K186A的聚糖和寡糖降解酶活均有所提高(聚糖酶活增加了 55%),其突变在不影响酶分子整体持续性的基础上增加了产物释放能力。此外,结构的分析还确定了一个可能影响酶分子催化的关键位点D208,其突变会导致酶分子对聚糖及可溶性寡糖的催化能力丧失。总之,酶分子活性架构中带电氨基酸的突变分析表明其在酶分子结合与持续性催化过程中的功能,这为酶分子下一步的设计提供了新的思路。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q93;TQ920.1
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
    1.1 生物质资源概述
        1.1.1 生物质资源定义及组成
        1.1.2 生物质资源的特点
        1.1.3 生物质资源的综合利用与生物质废弃物的形成
    1.2 生物质废弃物的组成及特点
        1.2.1 生物质废弃物的分类
        1.2.2 植物细胞壁组成成分
        1.2.3 真菌细胞壁组成成分
        1.2.4 细菌细胞壁组成成分
    1.3 生物质废弃物主要降解酶系组成及特点
        1.3.1 植物细胞壁的主要降解酶系
        1.3.2 真菌细胞壁的主要降解酶系
        1.3.3 细菌细胞壁的主要降解酶系
    1.4 参与生物质废弃物转化的微生物及其功能基因组
        1.4.1 放线菌与生物质转化
        1.4.2 真菌与生物质转化
    1.5 生物质废弃物降解生境中微生物群落的动态变化与分析
    1.6 立题依据
第二章 生物质废弃物高效降解生境中嗜热放线菌的筛选与鉴定
    2.1 材料与方法
        2.1.1 样品来源
        2.1.2 培养基
        2.1.3 实验仪器与试剂
        2.1.4 生物质废弃物降解生境样品中嗜热菌种的筛选与纯化
        2.1.5 菌种分子鉴定
    2.2 实验结果与分析
        2.2.1 生物质废弃物降解生境样品中嗜热放线菌的筛选与纯化
        2.2.2 嗜热放线菌的形态学表征与鉴定
    2.3 小结与讨论
第三章 整合组学分析Streptomyces sp.F-3的降解偏好性
    3.1 材料与方法
        3.1.1 菌株和培养基
        3.1.2 实验仪器与试剂
        3.1.3 基因组测序
        3.1.4 摇瓶发酵
        3.1.5 生理生化测定
        3.1.6 酶活及酶谱测定
        3.1.7 粗酶液的LC-MS/MS检测
    3.2 实验结果与分析
        3.2.1 基因组预测分析胞内外代谢关键途径与相关功能基因
        3.2.2 不同碳源下F-3菌株生理生化性质动态分析
        3.2.3 利用酶谱技术分析不同碳源条件对菌体胞外功能酶系分泌的影响
        3.2.4 利用LC-MS/MS精细分析不同碳源诱导条件下胞外功能酶系的分泌差异
    3.3 小结与讨论
第四章 利用蛋白质组学方法分析Streptomyces sp.F-3对生物质废弃物的高效降解机制
    4.1 材料与方法
        4.1.1 菌株和培养基
        4.1.2 实验仪器与试剂
        4.1.3 摇瓶发酵
        4.1.4 LC-MS/MS质谱检测及数据库搜索
        4.1.5 数据分析
    4.2 实验结果与分析
        4.2.1 菌渣诱导嗜热链霉菌F-3功能酶系的表达差异分析
        4.2.2 嗜热链霉菌F-3分泌的真菌细胞壁降解酶系
        4.2.3 嗜热链霉菌F-3分泌的细菌细胞壁降解酶系
        4.2.4 系统分析F-3胞外蛋白的高效降解机制
        4.2.5 不同底物诱导嗜热链霉菌F-3胞内蛋白酶及转运蛋白表达差异分析
        4.2.6 聚类分析蛋白酶的作用机制
    4.3 小结与讨论
第五章 Streptomyces sp.F-3的几丁质高效降解协同机制分析
    5.1 材料与方法
        5.1.1 菌株和培养基
        5.1.2 底物制备
        5.1.3 LC-MS/MS分析胞外分泌蛋白
        5.1.4 基因克隆、表达和蛋白质纯化
        5.1.5 几丁质酶活性测定
        5.1.6 水解产物谱分析
        5.1.7 序列及结构生物信息学分析
    5.2 实验结果与分析
        5.2.1 基因组及结构域组成分析
        5.2.2 利用蛋白质谱分析几丁质酶的表达差异
        5.2.3 几丁质酶系的表征与生理生化测定
        5.2.4 几丁质酶对不同底物的降解特异性分析
        5.2.5 几丁质酶对不同底物作用模式差异分析
        5.2.6 GH18亚家族几丁质酶的结构生物信息学分析
        5.2.7 几丁质酶的协同作用分析
    5.3 小结与讨论
第六章 几丁质酶SsChi18A持续性作用的分子机制研究
    6.1 材料与方法
        6.1.1 菌株与质粒
        6.1.2 仪器与试剂
        6.1.3 培养基制备
        6.1.4 引物设计
        6.1.5 突变质粒的构建与扩增
        6.1.6 异源表达突变体蛋白及蛋白纯化
        6.1.7 生物信息学分析
        6.1.8 野生型和突变体蛋白的酶学性质测定
    6.2 实验结果与分析
        6.2.1 GH18家族几丁质酶活性架构中关键氨基酸组成分析
        6.2.2 持续性几丁质酶SsChi18A极性氨基酸与底物相互作用分析
        6.2.3 几丁质酶的异源表达和分离纯化
        6.2.4 野生型及突变体酶的催化活性测定
        6.2.5 野生型及突变体酶的寡糖水解产物谱测定
        6.2.6 SsChi18A中关键氨基酸影响酶水解活性的分子机制
    6.3 小结与讨论
全文总结与展望
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
学位论文评阅及答辩情况表

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